CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM HĨA HỌC VÀ KHẢ NĂNG HẤP PHỤ
3.2.1. Phân tích đặc điểm hóa học của pectin
Để xác định sự có mặt một số monosaccharide có trong pectin từ cỏ biển ngồi thành phần có các nhóm AUA, Methoxyl của gốc axit galactouronic, chúng tơi tiến hành phân tích thành phần hóa học của pectin, kết quả đƣa ra trên bảng 3.2.
Bảng f3.2: Thành phần monosaccharide của pectin từ các nguồn khác nhau
Mẫu
Thành phần monosacchride của pectin (%w/w)
Man Rham Glu Xyl Gal Ara
Cỏ biển E.
acoroides 4,5 9,8 7,0 3,3 5,2 3,5
Kết quả cho thấy thành phần monosaccharide của pectin tƣơng tự nhƣ pectin chiết từ cỏ biển Zostera caespitosa Miki và bã chanh [4, 25]. Đó là
ngồi thành phần chính là axit galatouronic cịn có các gốc đƣờng khác nhƣ Rhamnose, Galactose, Glucose, và Arabinose. Tuy nhiên khác biệt ở đây là hàm lƣợng glucose của mẫu pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides cao hơn các mẫu cịn lại, kết quả này có thể do quy trình chiết có thể thu nhận thêm tinh bột cùng với pectin. Hàm lƣợng rhamnose cao hơn các gốc đƣờng cịn lại có thể pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides là dạng cấu trúc rhamnogalacturonan. Để kiểm tra kết quả phân tích hóa học và các đặc trƣng của pectin, chúng tôi tiến hành đo phổ hồng ngoại (IR) và phổ Cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR).
3.1.2.1. Phổ hồng ngoại
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của pectin cỏ biển nghiên cứu thể hiện ở hình 3.1. Phổ hồng ngoại của pectin tự nhiên hình 3.1 cho thấy các giải
hấp thụ chính sau: vân phổ tại 3415 cm-1 thuộc về dao động của nhóm OH. Sự có mặt của các nhóm carbonyl (C=O) trong pectin đƣợc xác nhận bởi vân phổ tại 1642 cm-1. Trong khi đó, nhóm cacboxylic axit (COO-) đƣợc xác nhận thơng qua các tín hiệu dao động tại số sóng là 1403 cm-1
[26]. NHƣ vậy phổ hồng ngoại (IR) xác nhận sự có mặt nhóm C=O và COO trong phân tử pectin, điều này có nghĩa có mặt axit cacboxylic. Kết quả phù hợp kết quả phân tích hóa học của pectin.
Hình j3.1: Phổ hồng ngoại của mẫu pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides
3.1.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ 1H NMR (hình 3.2) cho thấy tại vùng trƣờng cao xuất hiện 03 cụm tín hiệu sau: cụm tín hiệu tại vùng 1,5 ppm thuộc về nhóm methyl của gốc đƣờng L-rhamnose, cụm tín hiệu tại vùng 1,7 ppm thuộc về nhóm acetyl tại vị trí 2-O và 3-O của gốc Galacturonat. Vùng anomer từ 4,8 ppm đến 5,45 ppm đƣợc cho là liên quan đến các tín hiệu H1 của các monomer sau: D- galacturonic axit, L-rhamnose và Glucose [29]. Nhƣ vậy trên phổ 1H NMR xác nhận có mặt của các gốc đƣờng nhƣ rhamnose, glucose và axit D- galacturonic. Sự có mặt 03 tín hiệu tại vùng anomer chứng tỏ trong mạch polysaccharide dạng pectin có 03 anomer khác nhau.
Phổ 13C NMR (hình 3.3) của pectin tƣơng đối đơn giản tuy nhiên vẫn cho các thông tin cần thiết về cấu trúc pectin cụ thể nhƣ sau. Tại vùng trƣờng thấp xuất hiện 02 tín hiệu tại 175,64 ppm và 175,98 ppm đặc trƣng cho các nhóm chức carboxylic C6 của 02 axit galacturonic không tƣơng đƣơng nhau. Trong vùng C-anomer chỉ thấy xuất hiện 01 tín hiệu tại 99,51 ppm, thuộc về nguyên tử C1 của gốc Galacturonat. Đây là những vị trí mà nguyên tử C liên kết với nhiều nguyên tử O nhất, do nguyên tử này chịu ảnh hƣởng của vòng pyrannose với 02 nhóm OH và đặc biệt là của nhóm COOH nên có mật độ điện tích cao nhất. Sự khơng đồng nhất giữa số các tín hiệu trong vùng C- anomer và H-anomer có thể là do có một vài tín hiệu Proton khơng thuộc về nguyên tử H1. Để làm rõ điều này và có thơng tin chính xác hơn về đặc tính cấu trúc của pectin, chúng tôi tiến hành phân tích phổ 2 chiều COSY và HSQC.
Phổ HSQC là một trong những cơng cụ hữu hiệu giúp ích cho việc tìm ra tƣơng quan giữa các nguyên tử C-H liên kết trực tiếp với nhau. Trên hình 3.4 là phổ HSQC của các mẫu nghiên cứu.
Trên phổ HSQC của mẫu pecin, 01 cacbon anomer GalA-C1 liên quan đến pic 5,463 ppm là GalA-H1. Đây là giá trị cộng hƣởng đặc trƣng của anomer Hα, từ đây cho phép khẳng định liên kết glycosit tại C-anomer của GalA là liên kết kiểu α. Trên phổ HSQC, trong vùng H-anomer xuất hiện 02 tín hiệu tại 5,059 ppm và 4,794 ppm, liên quan đến tín hiệu 71,89 ppm và 78,69 ppm. Những tín hiệu cộng hƣởng của nguyên tử C không thuộc về vùng C-anomer. Nhƣ vậy 02 tín hiệu có độ chuyển dịch hóa học trong vùng H- anomer nhƣng không thuộc về các tín hiệu H-anomer. Từ phổ HSQC cho thấy trong mạch polysaccharide dạng pectin chỉ có 01 anomer. Các tƣơng quan C- H trên phổ HSQC đƣợc dẫn ra trên bảng 3.4
Bảng g3.4: Tƣơng quan rút ra từ phổ HSQC
Pic tƣơng quan Tọa độ (ppm)
GalA-C1 / GalA-H1 99,51/5,463
C/ H 78,69/4,794
C/H 71,89/5,059
C/H 69,65/4,41
Trên phổ H-H COSY mối tƣơng quan giữa proton GalA-H1 5,463 ppm với GalA-H2 4,19 ppm đƣợc thể hiện rất rõ thông qua peak đƣờng chéo. Tƣơng tác giữa GalA-H2 với proton có độ dịch chuyển hóa học 4,301 ppm chính là tƣơng tác giữa GalA-H2 và GalA-H3. Từ GalA-H3 thông qua peak đƣờng chéo, độ chuyển dịch của GalA-H4 là 4,794 ppm. Từ phổ COSY đƣa ra số liệu tƣơng quan dẫn ra trên bảng 3.5
Bảng h3.5: Tƣơng quan rút ra từ phổ COSY
Pic đƣờng chéo Tọa độ (ppm)
GalA-H1/ GalA-H2 5,463/4,19
GalA-H2/ GalA-H3 4,19/4,41
GalA-H3/ GalA-H4 4,41/4,794
Theo số liệu phổ thu đƣợc từ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) có thể thấy pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides có cấu trúc phức tạp, trong đó sự lặp lại của các gốc đƣờng dƣờng nhƣ không theo quy luật, chính vì vậy mà trên phổ NMR chỉ thấy xuất hiện các tín hiệu liên quan đến gốc Galacturonat là monomer tạo thành mạch chính của pectin và một vài tín hiệu đƣợc gán cho sự có mặt của gốc đƣờng L-rhamnose. Độ chuyển dịch hóa học về trƣờng thấp của các tín hiệu proton tại vị trí GalA-H2, GalA-H4 đƣợc giải thích bởi sự hình thành liên kết glycoside tại 02 vị trí này. Đó là liên kết 1-4 trong mạch chính và liên kết mạch nhánh (1-2). Từ kết quả phân tích thành phần hóa học, phân tích phổ NMR có thể cho rằng pecin chiết từ cỏ biển E. acoroides là
dạng cấu trúc rhamnogalacturonan. Trong đó mạch chính là sự ln phiên của các gốc Galacturonat liên kết với nhau thơng qua liên kết 1-4 và có mạch với gốc rhamnose bằng liên kết (1-2).