CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHIẾT TÁCH VÀ THU NHẬN PECTIN
Hiệu suất chiết tách pectin
%
Từ cỏ biển E. acoroides thu đƣợc phân đoạn pectin tự nhiên có hiệu suất chiết là 12,5% với các tính chất hóa học nhƣ sau:
Trọng lượng tương đương EW
VNaOH: thể tích NaOH tiêu tốn từ xác định trọng lƣợng tƣơng đƣơng (z)
g/mol
Hàm lượng Methoxyl (MI)
VNaOH: thể tích NaOH tiêu tốn từ xác định chỉ số MI (y)
%
Hàm lượng axit anhydrouronic tổng (AUA)
%
Hàm lượng ester hóa (DE)
Bảng e3.1: Các chỉ số đặc trƣng của pectin từ cỏ biển E. acoroides.
Thành phần Đơn vị tính Hàm lƣợng
AUA % 50,3
DE % 62,0
MI % 8,9
Hàm lƣợng pectin trong cỏ biển E. acoroides sinh trƣởng tại khánh Hòa tƣơng đƣơng với hàm lƣợng pectin ở một số loài cỏ biển khác trên thế giới nhƣ: cỏ Zostera caespitosa Miki (10,8%) [6]; Zostera marina (10-11%),
Zostera pacifica (12%) [94], và cao hơn so với hàm lƣợng pectin từ cỏ
Phyllospadix iwatensis (6,91%) [8]. So với pectin có nguồn gốc từ thực vật
trên cạn, hàm lƣợng pectin cũng có sự khác biệt đáng kể nhƣ: hàm lƣợng pectin từ vỏ chanh (10,3-13,13%) [95], vỏ chanh dây (2,25-14,6%) [96], vỏ măng cụt Indonesia (1,16%) [96], vỏ cam (7,3-16,0%) [97]. Sự khác biệt này đƣợc giải thích bởi phƣơng pháp chiết cũng nhƣ nguồn nguyên liệu khác nhau.
Theo [6] thì hàm lƣợng AUA là chỉ số đánh giá độ tinh khiết của pectin chiết xuất từ nguồn nguyên liệu tự nhiên và sản phẩm pectin có độ tinh khiết cao thì chỉ số AUA tổng phải lớn hơn 65%. Tuy nhiên, theo liệu bảng 3.1. cho thấy hàm lƣợng AUA là 50,3 % nhƣ vậy pectin mà chúng tơi nhận đƣợc có độ tinh khiết không cao mà là dạng pectin dạng thơ do trong quy trình chiết chƣa qua giai đoạn tinh chế.
Khối lƣợng phân tử tƣơng đƣơng EW và chỉ số methoxyl (MI) là thông số quan trọng đánh giá khả năng tạo gel của pectin và các pectin thƣơng mại thƣờng có hàm lƣợng methoxyl nằm trong khoảng từ 8-11% [98]. Pectin thu nhận từ cỏ biển E. acoroides (bảng 3.1) có EW tƣơng đƣơng pectin với một
số pectin từ vỏ chanh, vỏ cam và pectin thƣơng mại. Điều này chứng tỏ rằng pectin từ cỏ biển có thể sử dụng nhƣ là tác nhân tạo gel.
Theo các kết quả nghiên cứu trƣớc đây, pectin thu nhận từ hai loài cỏ biển Z. marina và Phyllospadix iwatensis có chỉ số DE lần lƣợt là 7,9% và
10,2% [8]; những giá trị này thấp hơn nhiều so với pectin thu từ cỏ biển E. acoroide (bảng 3.1). Nhƣ vậy, pectin thu nhận từ cỏ biển E. acoroide trong
nghiên cứu hiện tại có chỉ số DE khá cao so với các loài cỏ biển đã đƣợc nghiên cứu và đƣợc cơng bố trƣớc đó. Sự khác nhau này có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: Pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides đƣợc thu nhận tại biển
Khánh Hòa của Việt Nam, là vùng biển nhiệt đới khác hoàn toàn so với pectin từ Z. marina và Phyllospadix iwatensis thu tại vùng biển ôn đới của Nga. Sự
khác nhau về vị trí địa lý, môi trƣờng sống và giống lồi có thể là nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về tính chất của pectin thu nhận đƣợc, trong đó có chỉ số DE.
3.2. PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM HĨA HỌC VÀ KHẢ NĂNG HẤP PHỤ KIM
LOẠI CỦA PECTIN
3.2.1. Phân tích đặc điểm hóa học của pectin
Để xác định sự có mặt một số monosaccharide có trong pectin từ cỏ biển ngồi thành phần có các nhóm AUA, Methoxyl của gốc axit galactouronic, chúng tơi tiến hành phân tích thành phần hóa học của pectin, kết quả đƣa ra trên bảng 3.2.
Bảng f3.2: Thành phần monosaccharide của pectin từ các nguồn khác nhau
Mẫu
Thành phần monosacchride của pectin (%w/w)
Man Rham Glu Xyl Gal Ara
Cỏ biển E.
acoroides 4,5 9,8 7,0 3,3 5,2 3,5
Kết quả cho thấy thành phần monosaccharide của pectin tƣơng tự nhƣ pectin chiết từ cỏ biển Zostera caespitosa Miki và bã chanh [4, 25]. Đó là
ngồi thành phần chính là axit galatouronic cịn có các gốc đƣờng khác nhƣ Rhamnose, Galactose, Glucose, và Arabinose. Tuy nhiên khác biệt ở đây là hàm lƣợng glucose của mẫu pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides cao hơn các mẫu cịn lại, kết quả này có thể do quy trình chiết có thể thu nhận thêm tinh bột cùng với pectin. Hàm lƣợng rhamnose cao hơn các gốc đƣờng cịn lại có thể pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides là dạng cấu trúc rhamnogalacturonan. Để kiểm tra kết quả phân tích hóa học và các đặc trƣng của pectin, chúng tôi tiến hành đo phổ hồng ngoại (IR) và phổ Cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR).
3.1.2.1. Phổ hồng ngoại
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của pectin cỏ biển nghiên cứu thể hiện ở hình 3.1. Phổ hồng ngoại của pectin tự nhiên hình 3.1 cho thấy các giải
hấp thụ chính sau: vân phổ tại 3415 cm-1 thuộc về dao động của nhóm OH. Sự có mặt của các nhóm carbonyl (C=O) trong pectin đƣợc xác nhận bởi vân phổ tại 1642 cm-1. Trong khi đó, nhóm cacboxylic axit (COO-) đƣợc xác nhận thơng qua các tín hiệu dao động tại số sóng là 1403 cm-1
[26]. NHƣ vậy phổ hồng ngoại (IR) xác nhận sự có mặt nhóm C=O và COO trong phân tử pectin, điều này có nghĩa có mặt axit cacboxylic. Kết quả phù hợp kết quả phân tích hóa học của pectin.
Hình j3.1: Phổ hồng ngoại của mẫu pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides
3.1.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ 1H NMR (hình 3.2) cho thấy tại vùng trƣờng cao xuất hiện 03 cụm tín hiệu sau: cụm tín hiệu tại vùng 1,5 ppm thuộc về nhóm methyl của gốc đƣờng L-rhamnose, cụm tín hiệu tại vùng 1,7 ppm thuộc về nhóm acetyl tại vị trí 2-O và 3-O của gốc Galacturonat. Vùng anomer từ 4,8 ppm đến 5,45 ppm đƣợc cho là liên quan đến các tín hiệu H1 của các monomer sau: D- galacturonic axit, L-rhamnose và Glucose [29]. Nhƣ vậy trên phổ 1H NMR xác nhận có mặt của các gốc đƣờng nhƣ rhamnose, glucose và axit D- galacturonic. Sự có mặt 03 tín hiệu tại vùng anomer chứng tỏ trong mạch polysaccharide dạng pectin có 03 anomer khác nhau.
Phổ 13C NMR (hình 3.3) của pectin tƣơng đối đơn giản tuy nhiên vẫn cho các thông tin cần thiết về cấu trúc pectin cụ thể nhƣ sau. Tại vùng trƣờng thấp xuất hiện 02 tín hiệu tại 175,64 ppm và 175,98 ppm đặc trƣng cho các nhóm chức carboxylic C6 của 02 axit galacturonic không tƣơng đƣơng nhau. Trong vùng C-anomer chỉ thấy xuất hiện 01 tín hiệu tại 99,51 ppm, thuộc về nguyên tử C1 của gốc Galacturonat. Đây là những vị trí mà nguyên tử C liên kết với nhiều nguyên tử O nhất, do nguyên tử này chịu ảnh hƣởng của vòng pyrannose với 02 nhóm OH và đặc biệt là của nhóm COOH nên có mật độ điện tích cao nhất. Sự khơng đồng nhất giữa số các tín hiệu trong vùng C- anomer và H-anomer có thể là do có một vài tín hiệu Proton khơng thuộc về nguyên tử H1. Để làm rõ điều này và có thơng tin chính xác hơn về đặc tính cấu trúc của pectin, chúng tôi tiến hành phân tích phổ 2 chiều COSY và HSQC.
Phổ HSQC là một trong những cơng cụ hữu hiệu giúp ích cho việc tìm ra tƣơng quan giữa các nguyên tử C-H liên kết trực tiếp với nhau. Trên hình 3.4 là phổ HSQC của các mẫu nghiên cứu.
Trên phổ HSQC của mẫu pecin, 01 cacbon anomer GalA-C1 liên quan đến pic 5,463 ppm là GalA-H1. Đây là giá trị cộng hƣởng đặc trƣng của anomer Hα, từ đây cho phép khẳng định liên kết glycosit tại C-anomer của GalA là liên kết kiểu α. Trên phổ HSQC, trong vùng H-anomer xuất hiện 02 tín hiệu tại 5,059 ppm và 4,794 ppm, liên quan đến tín hiệu 71,89 ppm và 78,69 ppm. Những tín hiệu cộng hƣởng của nguyên tử C không thuộc về vùng C-anomer. Nhƣ vậy 02 tín hiệu có độ chuyển dịch hóa học trong vùng H- anomer nhƣng không thuộc về các tín hiệu H-anomer. Từ phổ HSQC cho thấy trong mạch polysaccharide dạng pectin chỉ có 01 anomer. Các tƣơng quan C- H trên phổ HSQC đƣợc dẫn ra trên bảng 3.4
Bảng g3.4: Tƣơng quan rút ra từ phổ HSQC
Pic tƣơng quan Tọa độ (ppm)
GalA-C1 / GalA-H1 99,51/5,463
C/ H 78,69/4,794
C/H 71,89/5,059
C/H 69,65/4,41
Trên phổ H-H COSY mối tƣơng quan giữa proton GalA-H1 5,463 ppm với GalA-H2 4,19 ppm đƣợc thể hiện rất rõ thông qua peak đƣờng chéo. Tƣơng tác giữa GalA-H2 với proton có độ dịch chuyển hóa học 4,301 ppm chính là tƣơng tác giữa GalA-H2 và GalA-H3. Từ GalA-H3 thông qua peak đƣờng chéo, độ chuyển dịch của GalA-H4 là 4,794 ppm. Từ phổ COSY đƣa ra số liệu tƣơng quan dẫn ra trên bảng 3.5
Bảng h3.5: Tƣơng quan rút ra từ phổ COSY
Pic đƣờng chéo Tọa độ (ppm)
GalA-H1/ GalA-H2 5,463/4,19
GalA-H2/ GalA-H3 4,19/4,41
GalA-H3/ GalA-H4 4,41/4,794
Theo số liệu phổ thu đƣợc từ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) có thể thấy pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides có cấu trúc phức tạp, trong đó sự lặp lại của các gốc đƣờng dƣờng nhƣ không theo quy luật, chính vì vậy mà trên phổ NMR chỉ thấy xuất hiện các tín hiệu liên quan đến gốc Galacturonat là monomer tạo thành mạch chính của pectin và một vài tín hiệu đƣợc gán cho sự có mặt của gốc đƣờng L-rhamnose. Độ chuyển dịch hóa học về trƣờng thấp của các tín hiệu proton tại vị trí GalA-H2, GalA-H4 đƣợc giải thích bởi sự hình thành liên kết glycoside tại 02 vị trí này. Đó là liên kết 1-4 trong mạch chính và liên kết mạch nhánh (1-2). Từ kết quả phân tích thành phần hóa học, phân tích phổ NMR có thể cho rằng pecin chiết từ cỏ biển E. acoroides là
dạng cấu trúc rhamnogalacturonan. Trong đó mạch chính là sự ln phiên của các gốc Galacturonat liên kết với nhau thơng qua liên kết 1-4 và có mạch với gốc rhamnose bằng liên kết (1-2).
3.2.2. Nghiên cứu khả năng hấp phụ kim loại của Pectin
3.1.3.1. Ảnh hưởng của pH
Độ pH của dung dịch pectin có tầm quan trọng lớn trong việc xác định khả năng liên kết cation hóa trị hai của pectin. Cần có độ pH cao hơn ít nhất một đơn vị log trên pKa của pectin (2,8 đến 4,1) để đảm bảo hơn 50% nhóm cacboxyl phân ly và do đó, mật độ điện tích pectin đủ để hình thành các liên
kết chéo ion [99]. Độ pH thấp hơn giá trị này sẽ dẫn đến sự proton hóa các gốc galacturonic axit khơng methyl hóa, dẫn đến giảm khả năng liên kết. Theo Khotimchenko và cộng sự [100] tại các giá trị pH thấp hơn 2, pectin thƣờng kết tủa, do đó làm giảm khả năng liên kết. Tại các giá trị pH cao hơn 8, các polysaccharide nhƣ pectin trở nên khơng ổn định [ví dụ, do q trình khử phân giải [101], giải thích khả năng liên kết giảm. Ngồi ra, ở các giá trị pH rất cao (∼12) các hydroxit của cation có thể đƣợc hình thành, chẳng hạn nhƣ Zn(OH)42−. Các hydrocomplexes này đƣợc đặc trƣng bởi bán kính ngậm nƣớc lớn hơn và khó phân ly hơn, dẫn đến tƣơng tác hạn chế với pectin [100]. Từ những nghiên cứu trên trong phạm vi của đề tài chỉ khảo sát môi trƣờng pH 2,0-8,0.
Bảng i3.6: Ảnh hƣởng pH đến khả năng liên kết của ion Pb2+ với pectin (Q) pH Mẫu Pectin tự nhiên
(DE 62,0 %) Pectin (DE 42,0 %) Pectin (DE 21,0 %)
2 0,00 72,45 103,50 3 93,15 103,50 139,73 4 119,03 129,38 161,46 5 124,20 138,69 175,95 6 119,03 149,04 179,06 7 124,20 134,55 186,30 8 103,50 132,48 165,60 9 51,75 62,10 82,80 Đơn vị tính Q=mg/g pectin
Kết quả trong bảng 3.6 cho thấy:
Đối với mẫu pectin tự nhiên khả năng liên kết của ion Pb2+
với pectin (Q) tăng nhanh ở pH 2-4 cao nhất và thay đổi không đáng kể ở pH 4-7 giảm dần ở pH 7-9.
Đối với mẫu Pectin (DE 42 %) khả năng liên kết của ion Pb2+
với pectin (Q) tăng dần ở pH 2-6 cao nhất ở pH 6 giảm dần ở pH 6-9.
Đối với mẫu Pectin (DE 21 %) khả năng liên kết của ion Pb2+
với pectin (Q) tăng dần ở pH 2-7 cao nhất ở pH 7 giảm dần ở pH 7-9.
Hình o3.6: Ảnh hƣởng của pH đến hàm lƣợng (Q) ion Pb 2+ liên kết với pectin Bảng j3.7: Ảnh hƣởng pH đến khả năng liên kết của ion Cd2+ với pectin (Q).
pH Mẫu Pectin tự
nhiên (DE 62,0 %) Pectin (DE 42,0 %) Pectin (DE 21,0 %)
2 0,00 25,00 37,50 3 25,00 37,50 50,00 4 46,88 43,75 65,63 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 160.00 180.00 200.00 0 2 4 6 8 10 Q (m g /g ) pH
Ảnh hƣởng của pH đến khả năng liên kết của ion Pb2+ với pectin (Q)
5 50,00 56,25 71,88 6 50,00 65,00 72,50 7 46,25 62,50 65,63 8 41,88 50,00 50,00 9 18,75 18,75 25,00 Đơn vị tính Q = mg/g pectin Kết quả trong bảng 3.7 cho thấy:
Đối với mẫu pectin tự nhiên khả năng liên kết của ion Cd2+
với pectin (Q) tăng nhanh ở pH 2-4 cao nhất và thay đổi không đáng kể ở pH 4-7 giảm dần ở pH 7-9.
Đối với mẫu Pectin (DE 42 %) khả năng liên kết của ion Cd2+
với pectin (Q) tăng dần ở pH 2-6 cao nhất và thay đổi không đáng kể ở pH 6-7 giảm dần ở pH 7-9.
Đối với mẫu Pectin (DE 21 %) khả năng liên kết của ion Cd2+
với pectin (Q) tăng dần ở pH 2-4 cao nhất và thay đổi không đáng kể ở pH 4-7 giảm dần ở pH 7-9.
Hình p3.7: Ảnh hƣởng của pH đến hàm lƣợng (Q) ion Cd2+ liên kết với pectin. Trong nghiên cứu với các polysaccharide tự nhiên, pH dung dịch là một thơng số quan trọng vì trong thành phần của dung dịch có mặt đồng thời hợp chất pectin và ion kim loại là những chất mang điện tích và có điện thế với hợp chất pectin và ion kim loại sẽ đổi theo pH. Số vị trí liên kết hoạt động liên quan đến gốc carboxyl tự do sẽ thay đổi theo pH. Theo hình 3.6 và 3.7 cho thấy khi tăng pH của dung dịch từ 2 đến 9 thì giá trị Q tăng dần và đạt giá trị cao trong vùng pH từ 4 đến 7 và sau đó giảm dần. Tại pH nhỏ hơn 2 thuân lợi cho các proton H+
tấn cơng vào vị trí caboxyl trong phân tử pectin làm giảm hoạt động liên kết giữa carboxyl và ion kim loại, hơn nữa tại pH này dẫn đến tủa pectin dƣới dạng axit. Khi pH cao, pectin sẽ không ổn định trong môi trƣờng kiềm, pH hấp phụ tối ƣu là 5-7. Kết quả này tƣơng tự nhƣ các công bố của [102] khi nghiên cứu khả năng liên kết của pectin với một số ion kim loại hóa trị II nhƣ Ca2+
, Zn2+, Fe2+ Chúng tơi chọn pH =6 cho những nghiên cứu tiếp theo. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 0 2 4 6 8 10 Q (m g/g) pH
Ảnh hƣởng của pH đến khả năng liên kết của ion Cd2+ với pectin (Q)
3.1.3.2. Ảnh hưởng của thời gian khuấy
Bảng k3.8: Ảnh hƣởng của thời gian khuấy đến khả năng liên kết của ion Pb2+ với pectin (Q). Thời gian khuấy (phút) Mẫu Pectin tự nhiên (DE 62,0 %) Pectin (DE 42,0 %) Pectin (DE 21,0 %) 5 80,73 103,60 126,79 10 86,94 116,44 137,14 20 99,36 128,86 155,77 30 106,50 145,94 172,02 40 117,99 150,02 173,88 60 124,20 155,25 181,13 80 127,31 156,29 179,06 100 126,27 156,29 181,13 120 125,24 156,29 180,09 Đơn vị tính Q= mg/g pectin Kết quả trong bảng 3.8 cho thấy:
Đối với tất các mẫu pectin nghiên cứu khả năng liên kết của ion Pb2+
với pectin (Q) là tƣơng đồng, tăng dần ở thời gian khuấy 5-60 phút cao nhất và thay đổi không đáng kể ở thời gian khuấy ≥ 60 phút.
Bảng l3.9: Ảnh hƣởng của thời gian khuấy đến đến khả năng liên kết của ion Cd2+ với pectin (Q).
Thời gian khuấy (phút)
Mẫu Pectin tự nhiên (DE 62,0 %) Pectin (DE 42,0 %) Pectin (DE 21,0 %) 5 32,50 45,63 47,81 10 35,63 52,81 57,00 20 38,75 54,44 62,31 30 45,00 60,00 66,88 40 48,13 63,13 70,00 60 50,00 65,63 72,50 80 50,63 65,63 72,50 100 50,63 66,88 73,13 120 50,00 65,63 72,50 Đơn vị tính Q = mg/g pectin Kết quả trong bảng 3.9 cho thấy:
Đối với tất các mẫu pectin nghiên cứu khả năng liên kết của ion Cd2+
với pectin (Q) là tƣơng đồng, tăng dần ở thời gian khuấy 5-60 phút cao nhất