3.3.2 .Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp
4.3.Công nghệ nhân nuôi invitro
Công nghệ sản xuất invitro trên cơ sở sử dụng môi trường nhân tạo ñể sản xuất sinh khối lớn EPN. Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng gồm năm giai ñoạn chủ yếu như sau: i)phân lập VKCS từ xoang máu
của ấu trùng bướm sáp lớn ñã ñược gây nhiễm EPN chuyển sang môi trường laura Broth cho nhân ni sơ cấp để tuyển chọn khuẩn lạc chuẩn (pha I);
nhiễm vào mơi trường chicken offal để tạo sinh khối lớn VKCS; iv) nhân ủ tổ hợp EPN – VKCS trong vòng 24-28 ngày; v) thu hoạch EPN phối chế và bảo quản.
Công nghệ này khắc phục ñược những hạn chế của công nghệ in vivo và có khả năng thương mại hố chế phẩm sinh học EPN với giá thành thấp hơn.
4.3.1. Phân lập VKCS.
VKCS của EPN rất mẫn cảm với nồng ñộ Oxy thấp, thay ñổi ñộ thẩm
thấu, thiếu nguồn dinh dưỡng và nhân nuôi nhỏ hơn là các chủng thông thường khác (E.coli).
Pha sơ cấp Xenohabdus có thể được hướng dẫn theo bảng 43 dưới đây.
Các vi khuẩn sơ cấp có thể được bảo quản 17% trong môi trường dinh dưỡng glyseron trong chai martney và giữ ở 18oC. Thể treo này ñược làm tan nhanh
ở nước nóng 60oC. Các vi khuẩn có thể được bảo quản ở 12-24oC và cấy chuyền thường xuyên .
Phân lập và nuôi sơ cấp.
- Chuyển 10 ấu trùng vào các ẩm 10% vào một ñĩa petri cho nhiễm vào
khoảng 100IJs trên mỗi BSL. Khơng nên cho q nhiều nước đề tránh BSL bị ngập nước mà chết trước khi nhiễm tuyến trùng.
- Sau 24-48 giời khi ấu trùng BSL Chết chúng sẽ ñược chuyển vào một cốc thuỷ tinh và rửa bằng cồn trong vòng 5-10 phút.
- Mổ xác chết bằng một kéo hoặc bằng kim nhọn sắc ñã ñược khử trùng và lấy một giọt huyết tương lên NBTA sử dụng que cấy platin dạng vòng.
Chú ý: khi tác mỗ và lấy mẫu huyết tương và không làm vỡ ruột ấu trùng
BSL ñể tránh nhiễm bẩn.
- Ủ đĩa mơi trường nhân nuôi ở 25oc trong buồn tối.
- Chọn lấy một khuẩn lạc ñơn sơ cấp và nhiễm trở lại vào môi trường
- Nếu đĩa nhân ni chất lượng và khơng bị nhiễm bẩn (có thể phân loại bằng nhân ni thứ cấp này), có thể nhân ni bằng cách nhân nuôi tiếp theo.
Nhân nuôi thứ cấp
- Cấy chuyển một khuẩn lạc vào dịch YS- broth và ủ trong 1-2 ngày ở
nhiệt độ 25oc trong 200 vịng trên phút trong tối.
- Bổ sung thêm 15% glyserol vào dịch nhân ni, trộn lắc đều và lấy 2ml vào ống typ ñã khử trùng.
- Sau khi san dịch vào các ống typ, chuyển chúng san bảo quản ở -800c.
Luu ý: các ống typ cần ñược ghi nhãn tên chủng, ngày chuẩn bị mẩu. ðể
chắc chắn cần thêm mô tả ngắn nguồn giống nhân nuôi trong hồ sơ đơng lạnh -800c, nghĩa là số thứ tự của khay và hộp chứa mẩu, số chủng ni, đặc tính của chủng ( sơ cấp, thứ cấp)…
4.3.2. chuẩn bị môi trường nhân nuôi tổ hợp tuyến trùng
Từ nghiên cứu thành cơng quy trình cơng nghệ in vitro trên mơi trường
đặc trong bình tam giác, đề tài đã nghiên cứu, thay thế vật liệu sản xuất môi
trường chicken offal từ nguyên liệu lòng gia cầm, một loại vật liệu khá đắt, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
khơng sẳn có trên thi trường với khối lượng lớn bằng nguyên liệu mới là lòng gia súc (lòng lợn) một loại vật liệu khá rẻ, với giá trị tồn tại trên thị trường với khối lượng lớn. Giá rẻ khối lượng tồn tại trên thị trường lớn mà hiệu quả khơng thua kém gì lịng gia cầm.
chuẩn bị mơi trường chicken offal
Các nội quan như tim gan , ruột,… của gia cầm và gia súc đều có thể sử dụng được trong mơi trường nhân ni EPN.
a. Loại bỏ túi mật ( các muối mật có hại cho sự phát triển của tuyến trùng). Khơng được làm vỡ túi mật khi lấy nó ra.
C. Xay nghiến cho nhuyễn vật liệu, trước xay nên dùng kéo cắt ruột thành các ñoạn ngắn khoảng 15cm.
d. Bảo quản lạnh nếu chưa trộn môi trường ngay. Tốt nhất là trộn xong sau đó nếu mới bảo quản để giữ an tồn cho khơng gian trong tủ bảo quản.
e. Trộn trong nước và mỡ bò theo các tỷ lệ sau:
Môi trường nhân ni các lồi Steinernema : 8 Dung dịch offal + 2 phần nước (không mỡ bị).
Mơi trường nhân ni các lồi Heterorhabditis : 7 Dung dịch offal + 2 phần nước + 1 phần mỡ bị.
4.3.3. Chuẩn bị dụng cụ nhân ni
Tiến hành cắt xốp thành những miếng nhỏ (kích thước 1cm) sau đó trộn với mơi trường chicken offal đã chuẩn bị sẵn với tỷ lệ mơi trường/xốp (tính
theo trọng lượng) là 1.25/1. Mỗi bình tam giác cho một lượng 250-300ml (khoảng 100g) môi trường ñã trộn với xốp. Lau sạch miệng bình và bịt kín
bằng nút bơng bọc vải thưa và hấp ở 121 độ C trong 20 phút. Bình nhân ni
ñược làm lạnh một thời gian trước khi sử dụng. Trường hợp mơi trường có
mùi hơi thối do ngun liệu đã để lâu trước khi chế biến thì có thể sử dụng
chất khử mùi.
Chú ý: Trong suốt quá trình thao tác cần mang găng tay cao su. ðây là
một yêu cầu quan trọng ñể tránh nhiễm trùng cho môi trường nhân nuôi.
Dùng túi nilon chịu nhiệt thay cho bình tam giác và hộp nhựa để nhân
ni EPN có thể tiết kiệm chi phí nhân ni. Ngồi ra, có thể chuển trực tiếp các tùi nhân ni ra đồng ruộng ñể phun rải mà không cần qua khâu tách lọc
vừa mất nhiều thời gian vừa bị hao hụt.
4.3.4. Gây nhiễm vi khuẩn
Dịch nhân nuôi vi khuẩn sơ cấp nên ñược ủ trước một ngày trước khi
nhất nhân nuôi vi khuẩn trong 1 ống týp cho một bình nhân ni) có chứa 5ml nutrient broth. Tốt nhất ñể các ống týp qua ñêm trên máy lắc hoặc ít nhất xốy nước trong ống trước khi ủ.
Khi nhiễm rót một ống dịch vi khuẩn vào mỗi bình nhân ni. Lắc đều
để trộn lẫn dịch vi khuẩn với môi trường trong chất xốp nền. Ủ 2-3 ngày ở 250 ñộ C ñể vi khuẩn phát triển nhanh.
4.3.5. Gây nhiễm tuyến trùng và nhân giống tổ hợp(monoxenic)
Sau khi nhân nuôi vi khuẩn xong tiến hành nhiễm tuyến trùng vào các bình ñã chuẩn bị sẵn vi khuẩn. Một bình tam giác ban đầu có thể chia thành 7 bình mới. Dùng pipet hút 1 lượng nước chứa tuyến trùng khoảng 3-4ml và phun vào từng bình tại 3-5 ñiểm. Sau khi nhiễm tuyến trùng, tốt nhất là tránh rung lắc mạnh bình đang nhân nuôi tuyến trùng. ðể các bình nhân ủ trong
phịng tối ở nhiệt ñộ 25-280C, ẩm ñộ 75-80% trong thời gian 10-14 ngày cho
đến khi thấy tuyến trùng sinh sơi và bám đầy trên thành bình có thể thu hoạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi bình nhân ni có dấu hiệu không tốt hoặc bị nghi ngờ, IJs đã vơ
trùng bề mặt có thể phục vụ như chất gây nhiễm ban đầu. Khi chủng IJs
khơng nên cho quá nhiều nước cùng với tuyến trùng (tốt nhất là <5ml).
Sau 2-3 ngày kiểm tra xem các bình nhân ni có thành cơng khơng bằng cách lấy mẫu từ bình ni cấy trên MacConkey Agar hoặc NBTA (Nutri agar, bromthymol blue và tetrazolium choloride) và sau đó kiểm tra màu sắc vi khuẩn phù hợp và hình thái để biết độ thuần khiết.