3.3.2 .Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp
4.2. Công nghệ nhân nuôi invivo
Do khả năng xâm nhiểm và sinh sản của các loài tuyến trùng
Steinernema và Heterohabditis trong vật chủ cơn trùng và đặc biệt là do phổ
kí sinh của chúng ñối với cơn trùng rất rộng, có thể sử dụng nhiều loại côn
trùng làm vật liệu nhân nuôi, sản xuát tuyến trùng. Trong số cơn trùng vật chủ
được sử dụng làm sản xuất tuyến trùng EPN thì ấu trùng bướm sáp lớn – BSL được coi là cơn trùng khá lý tưởng ñể làm vật liệu ni đối với hầu hết các
lồi tuyến trùng EPN. BSL là côn trùng khá mẫn cảm với hầu hết các loài và chủng loài tuyến trùng EPN và là môi trường lý tưởng cho tuyến trùng sinh sản. lồi cơn trùng này sẳn có và dể ni bằng vật liệu tự nhiên là sáp ông hoặc vật liệu nhân tạo. Một ấu trùng bướm sáp lớn có thể cho thu hoạch tới
200000 IJS của S.feltiae và của H. bacteriophora.
Tuy nhiên số lượng IJS ñược sản xuất trên một ấu trùng bướm sáp lớn
phụ thuộc vào chủng loài tuyến trùng và mật ñộ gây nhiểm ban ñầu. các
chủng lồi tuyến trùng EPN có kích thước IJs nhỏ như ở hầu hết các lồi
Heterohabditis thì sản lượng lơn ngược lại kích thước lớn như ở hầu hết các
30000 – 50000 IJS. Quy trình sản xuất invivo chủ yếu tham khảo theo phương pháp Poinar (1979) với hàng loạt các thay ñổi khác nhau.
Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học EPN bằng in vivo trên cơ sở sử dụng ấu trùng tuổi 5 của BSL làm vật liệu nhân nuôi , gồm các bước như sau: i)nhân nuôi sản xuất ấu trùng BSL ; ii)gây nhiễm IJS cho BSL và nhân ủ
trong 12-14 ngày ; iii)thu hoặch IJS bằng kỹ thuật bẫy nước phối chế bảo quản IJs.
Công nghệ nhân ni in vivo khá đơn giản , khơng cần đầu tư lờn, vì vậy có áp dụng quy mơ hộ gia đình, các trang trại hoặc các đơn vị sản xuất nhỏ.
Tuy nhiên cơng nghệ này có nhược điểm là năng xuất thấp, chất lượng khơng
ổn ñịnh và ñặc biệt là tôn nhiều công lao ñộng nên giá thành cao.
Trước khi nhân nuôi sản xuất in vivo tuyến trùng cần tạo vật liệu nguồn
ấu trùng BSL. Quy trình nhân ni và sản xuất BSL ñược trình bài ở phần
sau.
4.2.1. Xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL
Tuyến trùng xâm nhiễm IJs thường ñược bảo quản lạnh từ 12 – 14oC trước khi xâm nhiễm nên ñể IJs ấm dần lên đến nhiệt độ phịng (20-240C). kiểm tra tuyến trùng dưới kình hiển vi soi nổi. Tuyến trùng còn sống tốt sẽ chuyển ñộng. Lấy 1ml tuyến trùng và pha trong một lượng nước xác định sao cho có nồng độ tuyến trùng ñạt 200IJS/ml. ðếm số lượng IJs bằng hợp ñếm
dưới kính hiển vi soi nổi để biết chính xác mật độ IJs và trên cơ sở đó điều
chỉnh nồng ñộ tuyến trùng ñạt 200IJS/ml bằng thêm hay bớt một lượng nước hợp lý ñể ñạt ñược nồng độ trên.
Khi có được nồng độ mong muốn thì hút từng ml dung dịch chứa tuyến trùng và cho vào trên giấy lọc. Mỗi hộp cho vào 10 ấu trùng BSL ñã qua xử lý nhiệt để khơng tạo kén. Như vậy nồng ñộ gây nhiễm là khoảng 200IJs/BSL.
tranh và bị ơ nhiễm bởi vi khuẩn bên ngồi. ñậy nắp hộp chứa tuyến trùng và vi khuẩn bên ngồi. Dán nhãn và để trong túi nilon. ðặt trong tối ở nhiệt độ
phịng. Sau khi gây nhiễm hầu hết BSL ñều chết, cẩn thận chuyển BSL ñã
chết vào white trap(white 1927)
Thông thường BSL bị nhiễm EPN và chết sẽ khơng có mùi thúi và có màu sắc khá đặc trưng. BSL bị nhiễm Steinerma sẽ có màu hơi vàng nâu và mềm khi gấp bằng kẹp còn BSL bị nhiễm Herterohabditis sẽ có màu đỏ gạch và cứng hơn môt chút. Những con BSL bị chết do nhiễm nặng hay chết bởi các nguyên nhân khác thường màu hơi đen và có mùi thối. tơt nhất là khơng
thu tuyến trùng từ những con này vì số lượng ít và chúng có thể gây ơ nhiễm nặng cho cả ñợt.
4.2.2. Thu hoạch tuyến trùng IJs
Làm bẫy nước (white trap) theo white (1927): ðặt giấy lọc whatman
N01- 90mm trên mặt lõm của ñĩa ñồng hồ trong ñĩa petri thuỷ tinh lớn. ðặt
vào nồi hấp 20 phút ở 1210C. Cho vào ñĩa petri khoảng 70ml nước cất hoặc cho thêm formalin ñể tạo thành dung dịch 0.1% formalin. Chú ý: khơng được
để nước nhỏ vào mặt lõm của ñĩa ñồng hồ. ðặt giấy lọc lên trên ñĩa ñồng hồ
và gập mép giấp ngược về phía đáy đĩa, sao cho khi ñặt vào ñĩa petri chứa
nước, mép giấy tiếp xúc với bề mặt nước. Mỗi ñĩa như vậy khoảng 20-30
Hình 4.1. Ấu trùng BSL
Thơng thường sau khi nhiễm từ 10-12 ngày, IJs sẽ bắt ñầu phát tán ra
khỏi BSL và khi chuyển vào nước trong đĩa petri. Cịn xác BSL cịn lại trên
ñĩa ñồng hồ. khi tuyến trùng xuất hiện trong ñĩa petri nên tiến hành thu chúng
hàng ngày tới khi số lượng giảm (3-4-ngày). ðể thu hoạch, nhấc đĩa có chứa BSL ra, rót nước chứa IJs vào cốc (rữa ñĩa petri ñể thu huyết trùng) thêm
70ml nước cất hoặc 0.1% formalin và thay ñĩa ñồng hồ.
Với hầu hết tuyến trừng EPN thì ấu trùng thoát ra khỏi vật chủ BSL cũng là IJs thuần chủng, nhưng với S.glaseri, khi ấu trùng mới thoát ra từ xác chết của côn trùng thì chúng chỉ là dạng ấu trùng tiền xâm nhiềm và nếu tuyến
trùng này di chuyển ngay vào môi trường lỏng chúng sẽ không phát triển hồn tồn thành dạng IJs được. ðể cho chúng thành IJs cần thay ñĩa ñồng hồ và giấy lọc bằng ñĩa petri ñược chuẩn bị ñặc biệt. ðĩa petri này chứa lớp
mỏng khoảng 2mm plaster, ñể lớp laster này khô và làm ẩm không nên sũng
ướt. kiểm tra mức ñộ ẩm trước khi thu hoạch cộng thêm vài giọt nước nếu
chuyển trong hai đến ba ngày vào mơi trường nước hoặc 0.1% formalin trong
ñĩa petri thuỷ tinh lớn hơn. Chúng có thể thu bằng cách thơng thường.
4.2.3. Chuẩn bị cho bảo quản
kiểm tra IJs còn hoạt động, Mơ vật chủ hoặc tuyến trùng khơng phải IJs phải được loại bỏ. nếu có vấn đề phát sinh hoặc số lớn tuyến trùng khơng hoạt
động cần được xem xét xử lý hoặc loại bỏ, trong khi tiến hành rửa cuối cùng.
Tách IJS ra khỏi xác chết vật chủ, môi trường nhân nuôi hoặc tạp chất khác bằng cách cho IJs di chuyển qua rây lọc có kích thước lổ thích hợp (60- 60µm) để giữ lại mơ vật chủ và tuyến trùng ở các giai đoạn khơng lây nhiễm. các giai đoạn khơng xâm nhiễm. Các giai đoạn khơng xâm nhiễm có thể bị
giết khi rửa tuyến trùng bằng dung dịch Hyamine 0.4% trong 15 phút. Nếu muốn tất cả các giai ñoạn không xâm nhiễm cũa hai giai ñoạn Steinerma và
Herterohabditis đều có thể bị chết ở nhiệt độ phịng trong một vài ngày .
ðể rửa tuyến trùng, cho chúng vào một cái cốc, ñể tuyến trùng lắng đọng, gạn phần nước phía trên và cho phần nước sạch vào cho ñến khi dung
dịch sạch từ 2-4 lần. Nếu dung dịch bị ô nhiễm nặng chúng có thể rửa một lần bằng dung dịch formalin. Có thể ly tâm ở tốc độ 300 vịng /phút trong 1 phút có thể đẩy nhanh q trình này. Trong thời gian ngắn tuyến trùng có thể được cất giữ qua ñêm trong tủ lạnh nhưng nên rửa ít nhất 1 lần trước khi cho vào tủ lạnh. Cuối cùng chuyển tuyến trùng cho vào lọ bảo quản.