Nguồn:http://www.academicjournals.org/AJB [6]
Đoạn cDNA của virút cúm được chèn vào giữa hai vị trí nhận biết của enzyme giới hạn BsmBI.
Hệ thống plasmid chứng dương
Hệ thống plasmid chứng dương gồm tám plasmid pHW2000 mang tám đoạn cDNA tương ứng tám phân đoạn gen của virút cúm A/PR/8/34 (H1N1). Hệ thống plasmid chứng dương được sử dụng trong q trình nhân dịng đoạn gen virút cúm (nhân định kết quả PCR, kiểm tra plasmid mang ADN đích) và q trình chuyển nhiễm tạo virút cúm từ hệ thống chuyển nhiễm plasmid.
2.2.2. Sinh phẩm và hóa chất
Các bộ sinh phẩm, hố chất sử dụng trong nghiên cứu có quy trình hướng dẫn thực hiện kèm theo, các bước thực hiện liên quan được tiến hành theo hướng dẫn của bộ sinh phẩm.
* Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Hệ thống mồi dùng khuếch đại các phân đoạn gen đích bằng PCR
Các cặp mồi sử dụng cho PCR được thiết kế với mục đích tổng hợp các phân đoạn gen chiều dài đủ của các chủng virút cúm A, đồng thời phù hợp cho q trình nhân dịng vào vector pHW2000. Hệ thống mồi này được sử dụng chung cho các chủng virút trong nghiên cứu.
Bảng 2.1. Hệ thống mồi dùng khuếch đại các phân đoạn gen đích
Gen Mồi xi Mồi ngƣợc
Sản phẩm [bp] PB2 Ba-PB2-1 TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTC Ba-PB2-2341R ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT 2341+29 PB1 Bm-PB1-1 TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCA Bm-PB1-2341R ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT 2341+29
PA Bm-PA-1 TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTAC Bm-PA-2233R ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT 2233+29
HA Bm-HA-1 TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG Bm-NS-890R ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT 1778+29 NP Bm-NP-1 TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA Bm-NP-1565R ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT 1565+29 NA Ba-NA-1 TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT Ba-NA-1413R ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 1413+29 M Bm-M-1 TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG Bm-M-1027R ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 1027+29 NS Bm-NS-1 TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG Bm-NS-890R ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT 890+29
Trình tự mồi gồm: trình tự nhận biết của enzyme BsmBI hoặc BsaI ở đầu 5’
(màu xanh); và trình tự đặc hiệu virút cúm (màu đen), trình tự đặc hiệu mỗi phân đoạn gen (gạch chân).
Hệ thống mồi sử dụng cho quá trình giải trình tự
Hệ thống mồi được sử dụng cho quá trình giải trình tự gồm:
- Cặp mồi đặc hiệu với vector pHW2000: pHW180F và pHW100R - Các mồi đặc hiệu với mỗi đoạn gen đích.
- Các cặp mồi dùng để khuếch đại gen đích (Bảng 2.1).
Bảng 2.2. Hệ thống mồi dùng cho quá trình giải trình tự nucleotide
Tên mồi Trình tự PB2 PB2 324R: 5’-GGTGGTACAATGTCGGTTTCC-3’ PB2 476F: 5’-GTCATGCAGACCTCAGTGCCA-3’ PB2 974F: 5’-GATTGAGAATCAGCTCATCC-3’ PB2 1537F: 5’-GTTCGAGACCAACGTGGGAATG-3’ PB2 1988F: 5’-CTGTATTCAACTACAACAAG-3’ PB1 PB1 297R: 5’-TCGGAGGTCCTGTGTCAGACAA-3’ PB1 522F: 5’-CCTCAAGGATGTGATGGAATCA-3’ PB1 923F: 5’-TCACAATCACTGGGGACAACACTA-3’ PB1 1513F: 5’-TATCGATATGGATTTGTGGC-3’ PB1 1969F: 5’-CATGGTCCAGCCAAAAGTATG-3’ PA PA 380R: 5’-AGCTACTTAGACAAGAGGAAC-3’ PA 534F: 5’-GATTAAGACCAGGCTGTTTACC-3’ PA 892F: 5’-CCTTATATAGTCAAACCACAC-3’ PA 1522F: 5’-TTATATGGATTCATCATAAAGG-3’ PA 1930F: 5’-GTCTGTAGGACTCTATTGGCT-3’ HA HA 387R: 5’-TCCACAAAGTTAAGAAGTATCAGT-3’ HA 535F: 5’-GAACAGTACATACCCAACAATA-3’ HA 997F: 5’-ATCAAACAGATTAGTCCTTGCG-3’ HA 1426F: 5’-CAAGGTCCGACTACAGCTTAGG-3’ NP NP 350R: 5’-GGTAGATGAGAGGACATATAC-3’ NP 457F: 5’-ATCTGGCATTCCAATTTGAAT-3’ NP 991F: 5’-ATCAGACCTAACGAGAATCCA-3’ NA NA 334R: 5’-CTCGTACTCTACTTACCGAGAG-3’ NA 497F: 5’-GTCAGCAAGTGCTTGCCATGATG-3’ NA 1017F: 5’-TACGGCAATGGTGTCTGGATC-3’ M M 481F: 5’-ACAGATTGCTGACTCCCAGCAC-3’ M 269R: 5’-AAACCTGTTTCGCAGATGCGAC-3’ M 803F: 5’-GAGTATCATTGGGATCTTGC-3’ NS NS 690F: 5’-ATGGCGAGAACAGCTAGGTCA-3’ NS 316R: 5’-GTTATCAGTACAGTCAATACA-3’ pHW180F GCG GTA GGC GTG TAC GGT GG
Cặp mồi chẩn đốn phân típ H5: H5-1 và H5-3 được cung cấp bởi TCYTTG, sản phẩm khuếch đại có chiều dài 219bp
* Sinh phẩm và hố chất cho q trình nhân dịng các đoạn ADN đích
Mục đích Sinh phẩm Cat. No Hãng
Tách chiết ARN QIAamp viral ARN Mini Kit (250) 52904 QIAGEN
Tổng hợp ADN bổ trợ
(cDNA) SuperScriptIII Reverse Transcriptase 18080-044 Invitrogen
PCR HotStar HiFidelity Polymerase Kit 202602 QIAGEN Tinh sạch sản phẩm
PCR
Wizard SV Gel & PCR Clean-Up
System A9282 Promega
Tách plasmid
(miniprep) QIAprep Spin Miniprep Kit 27106 QIAGEN
Tách plasmid
(midiprep) Nucleobond Xtra Midi 740410.50
ACHEREY – NAGEL Xử lí vector,
ADN đích BsmBI R0580S NEB
Xử lí ADN đích BsaI NEB
Gắn ADN T4 DNA Ligase 15224-017 Invitrogen
Tế bào khả biến One Shot MAX Efficiency DH5αTM –
T1R 44-0097 Invitrogen
Môi trường nuôi vi khuẩn
LB (Luria-Bertani) agar L2897 SIGMA-
ALDRICH
LB (Luria-Bertani) broth L3022 SIGMA-
* Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide
- Bộ sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing P/N, Cat.No 4336917, hãng ABI (Applied Biosystems)
- Bộ sinh phẩm DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen (Cat.No: 63206)
* Chuyển nhiễm plasmid vào tế bào động vật có vú:
- Sinh phẩm: Lipofectamine2000, INVITROGEN, Cat. No 11668-027 - Tế bào: 293T
- Môi trường: Opti-MEM I Reduced Serum Medium Cat. No 51985-091; DMEM High Glucose (Cat. No 11995), INVITROGEN.
* Phân lập virút:
- Môi trường phát triển tế bào: DMEM chứa 10% FCS (Fetal Cafl serum) - Môi trường phân lập tế bào: DMEM 2% BSA, Trypsin TPCK (0,001 mg/ml)
* Phản ứng ngƣng kết hồng cầu
Hồng cầu gà 0,5%; Dung dịch đệm PBS
2.2.3. Hệ thống cảm nhiễm virút cúm
- Trứng gà có phơi 10 ngày được cung cấp bởi Viện chăn nuôi Việt Nam - Tế bào MDCK có nguồn gốc từ ATCC – Trung tâm nguồn sinh học toàn cầu.
2.2.4. Trang thiết bị và dụng cụ
Phịng thí nghiệm An tồn sinh học cấp III:
Tên thiết bị
Tủ an toàn sinh học cấp II Tủ 40C, tủ -800C
Tủ ấm
Máy ly tâm tuýp Eppendoff Máy ly tâm tuýp 15ml / 50 ml.
Hãng sản xuất Bioquell Sanyo Sanyo Beckman-Coµlter Beckman-Coµlter
Phịng thí nghiệm An tồn sinh học cấp II:
Tên thiết bị
Tủ An toàn sinh học II Tủ -200C, -800C
Máy ly tâm tuýp Eppendoff Máy siêu ly tâm
Máy PCR
Máy phân tích trình tự gen ABI-3130 Avant Tủ ấm lắc Tủ ấm Hãng sản xuất Bioquell Sanyo Beckman-Coµlter Beckman-Coµlter Biorad Hitachi GFL Sanyo - Dụng cụ thí nghiệm: Pi-pét các loại: từ 0,5µl đến 1000 µl,
Đầu cơn vơ trùng các loại, có phin lọc: từ 1µl đến 1000µl
Phiến nhựa 6 giếng, phiến nhựa 96 giếng đáy chữ V, chai nuôi tế bào 75cm2… Tuýp vô trùng các loại: 0,2 ml; 1,7ml, 2,0ml.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Quy trình xây dựng hệ thống chuyển nhiễm ADN có khả năng tổng hợp virút cúm A và tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 được tóm tắt trong hình 2.2.
Hình 2.2. Quy trình xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả năng tạo virút cúm A và quy trình tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2.
2.3.1. Lựa chọn chủng virút gốc
Chủng virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 được lựa chọn từ các chủng hiện đang lưu giữ tại PTN Cúm, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Chủng virút cúm được lựa chọn phải có hiệu giá ngưng kết hồng cầu (HA) tối thiểu 8.
2.3.2. Chuẩn bị vector nhân dòng
Khuếch đại plasmid:
- Biến nạp plasmid pHW2000 vào tế bào cảm biến E.coli chủng DH5-T1 bằng
phương pháp sốc nhiệt
- Sử dụng môi trường LB thạch để lựa chọn tế bào mang plasmid.
- Khuếch đại tế bào mang plasmid trong môi trường LB lỏng (100 – 200 ml).
Tách plasmid từ tế bào vi khuẩn: Sử dụng Nucleobond Xtra Midi Kit. Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn:
Hàm lượng plasmid được cắt: 5 µg. - Cắt plasmid bằng enzyme BsmBI.
- Tinh sạch plasmid bằng Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System.
- Xác định nồng độ plasmid sau xử lí bằng máy nanodrop. Bảo quản plasmid ở nhiệt độ -700C.
2.3.3. Chuẩn bị ADN nhân dòng Tách chiết ARN Tách chiết ARN
Sử dụng QIAamp viral RNA Mini Kit (QIAGEN ) để tách chiết ARN từ chủng virút phân lập, thực hiện theo quy trình hướng dẫn.
Tổng hợp ADN bổ trợ (cDNA)
Sử dụng bộ sinh phẩm SuperScriptIII Reverse Transcriptase - INVITROGEN. Theo quy trình của bộ sinh phẩm, thể tích cDNA thu được từ mỗi phản ứng là 24 µl. Trong nghiên cứu này, thực hiện 02 phản ứng để có tổng thể tích là 48 µl.
Thực hiện PCR
Sử dụng bộ sinh sinh phẩm HotStar HiFidelity Polymerase (QIAGEN), máy PCR Biorad.
Với mỗi đoạn gen đích, thực hiện 2 phản ứng, tổng thể tích sản phẩm PCR là 100 µl.
(chi tiết xem phụ lục 2)
Điện di sản phẩm PCR
Điện di để kiểm tra kết quả PCR và quá trình tinh sạch sản phẩm PCR. Sử dụng gel agarose 0.8% có ethidium bromide (10µl / 100 ml dung dịch agarose), hiệu điện thế 100 vol trong 30 phút, thang AND chuẩn 1kb (Promega), quan sát và chụp ảnh dưới tia UV.
Nhận định kết quả
Dựa vào kích thước đầy đủ của sản phẩm PCR khi thiết kế mồi và thang ADN chuẩn để lựa chọn ADN đích (sản phẩm mong muốn).
Tinh sạch ADN đích:
Sử dụng bộ sinh phẩm Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System
Xử lí ADN đích với enzyme giới hạn:
- Cắt ADN đích bằng enzyme BsmBI hoặc BsaI tương ứng với mỗi loại cặp mồi. - Tinh sạch bằng bộ sinh phẩm Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System.
2.3.4. Nhân dịng ADN đích vào plasmid pHW2000
Đƣa ADN đích vào plasmid:
Sử dụng T4 DNA ligase để gắn ADN đích vào plasmid pHW2000 đã xử lí tạo plasmid tái tổ hợp, thực hiện theo quy trình của bộ sinh phẩm
Biến nạp vào tế bào khả biển
Sử dụng phương pháp sốc nhiệt để biến nạp 5 µl plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coli (DH5α – T1).
Cấy trải tế bào đã biến nạp trên môi trƣờng LB thạch
- Chuẩn bị mơi trường LB thạch có kháng sinh Ampicilline (0,05mg/ml). - Cấy trải 150 µl vi khuẩn trên đĩa LB thạch
- Ủ đĩa thạch chứa vi khuẩn ở 370C, từ 18 – 20 giờ.
Xác định khuẩn lạc chứa plasmid mang ADN đích
- Chuẩn bị mơi trường LB lỏng có Ampicillin (0,05mg/ml). - Chia 3 – 5 ml môi trường LB lỏng vào tuýp li tâm 15 ml. - Nhặt khuẩn lạc từ đĩa thạch LB vào tuýp môi trường LB lỏng. - Ni vi khuẩn trong điều kiện 370C, 170 vịng/phút, từ 18 – 20 giờ. - Tách ADN plasmid, sử dụng QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). - Điện di plasmid trên gel agarose 0,8%.
- Lựa chọn plasmid mang ADN đích, bảo quản ở -200C.
Vi khuẩn chứa plasmid mang ADN đích: thêm 200 – 500 µl Glycerol tiệt trùng vào 500 µl vi khuẩn, trộn đều, bảo quản ở -700C.
2.3.5. Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide (sequence)
Mục đích:
- Xác định trình tự nucleotide các đoạn ADN đích tổng hợp từ gen đích (trước nhân dịng) - Xác định trình tự nucleotide các đoạn ADN đích trong plasmid (sau nhân dịng)
- Xác định trình tự nucleotide các phân đoạn gen của virút cúm tổng hợp bằng hệ thống chuyển nhiễm ADN plasmid
Chu kì nhiệt tạo các đoạn ADN gắn dideoxynucleotide (Cycle sequencing)
Sử dụng sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit P/N.
Thành phần phản ứng
Thành phần Thể tích (µl)
Terminator Ready Reaction Mix ADN
Mồi (3,2 pmol) xuôi hoặc ngược Nước cất tinh sạch 8 2 1 9 Tổng 20
Ly tâm nhẹ hỗn hợp phản ứng trước khi cho vào máy PCR.
Chu trình nhiệt của phản ứng:
Nhiệt độ Thời gian (phút:giây) Số chu kì
960C 1:00 1 960C 500C 600C 0:10 0:05 4:00 25
Tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide
- Mục đích: loại bỏ các dideoxynucleotide và sinh phẩm dư thừa, tránh nhiễu trong quá trình giải trình tự.
- Sử dụng bộ sinh phẩm DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen (Cat.No: 63206) theo hướng dẫn kèm theo bộ sinh phẩm.
Điện di qua mao quản và đọc trình tự nucleotide bằng đầu đọc laser
- Cho 10 µl HiDi Formamide (HiDi Formamide ABI 25 ml P/N: 4311320) vào tuyp 1.5 ml chứa ADN sau khi làm khô (2.3.4.2)
- Chuyển toàn bộ sản phẩm sang phiến 96 giếng (phiến chuyên dùng cho ABI PRISM 3100 – Avant)
- Ủ phiến ở 960C trong 5 phút - Chuyển phiến vào giá giữ lạnh
- Đặt phiến 96 giếng vào máy ABI PRISM 3100 – Avant
- Cài đặt chương trình chạy, thu kết quả từ tệp dữ liệu khi phản ứng kết thúc.
Phân tích các trình tự chuỗi thu đƣợc.
Sử dụng phần mềm phân tích DNAstar và SeqMan để phân tích các trình tự chuỗi thu được: nối các đoạn nucleotide thành một đoạn gen hồn có chiều dài đầy đủ; kiểm tra cấu trúc gen (chiều dài gen, chiều dài ORF, vùng khơng mã hóa).
2.3.6. Chuẩn bị plasmid cho quá trình chuyển nhiễm
- Lấy 100 µl vi khuẩn được bảo quản trong glycerol cho vào 100 – 200 ml môi trường LB lỏng.
- Xác định nồng độ ADN plasmid bằng máy nanodrop ở bước sóng 260nm. - Bảo quản plasmid ở -700C.
2.3.7. Chuyển nhiễm plasmid vào tế bào
Sử dụng sản phẩm plasmid tách bằng Nucleobond Extra Midi Kit cho quá trình chuyển nhiễm.
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị tế bào: 1 ngày trước khi tiến hành chuyển nhiễm, tách tế bào 293T với số lượng là 1 x 106tế bào / giếng trong 3 ml môi trường DMEM High glucose (sử dụng phiến nhựa 6 giếng).
- Với mỗi mẫu chuyển nhiễm, chuẩn bị hỗn hợp sau:
Hỗn hợp (1): cho 1ug mỗi plasmid x 8 ADN plasmid vào 250 µl mơi trường Opti-MEM, trộn nhẹ bằng pi-pét.
Hỗn hợp (2): Pha loãng Lipofectamine2000 trong 250 µl mơi trường Opti- MEM, ủ 5 phút ở nhiệt độ phịng.
Trộn hỗn hợp (1) và (2) (tổng thể tích là 500 µl), ủ 20 phút ở nhiệt độ phịng. - Loại bỏ môi trường DMEM trong phiến tế bào, thay bằng 1ml môi trường Opti-MEM. Sau đó, nhỏ 500 µl hỗn hợp (1) và (2) vào giếng tế bào và lắc nhẹ phiến.
- Sau 4 giờ chuyển nhiễm, thêm môi trường Opti-MEM vào mỗi giếng để đạt thể tích là 3 ml. Ủ phiến tế bào đã chuyển nhiễm ở 370C, 5% CO2 trong tối đa 72 giờ.
2.3.8. Khuếch đại virút
Trứng gà có phơi:
- Dùng kim tiêm 1ml hút 200 µl mẫu rồi tiêm vào túi niệu của trứng rồi gắn kín lỗ thủng trên vỏ trứng.
- Ủ trứng ở 370C, 5% CO2 trong tối đa 3 ngày. Theo dõi hàng ngày để phát hiện quả trứng có phơi chết.
- Làm lạnh trứng trước khi tiến hành thu virút (thu dịch niệu) (40C, qua đêm). - Loại bỏ phần vỏ trứng phía trên túi niệu. Dùng pi-pét hoặc kim tiêm để thu toàn bộ dịch niệu chứa virút. Li tâm trong 10 -15 phút, 3000 vòng/phút để loại bỏ cặn lắng, thu phần dịch trong.
Tế bào MDCK
- Trước khi phân lập 1-2 ngày, tách tế bào MDCK rồi nuôi trong chai 25cm2 để tạo thành một lớp tế bào, sử dụng môi trường phát triển tế bào.
- Rửa tế bào bằng dung dịch PBS (-) 2 lần, loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa. - Thêm 500 µl mẫu vào chai tế bào. Ủ ở 370C, 5% CO2 trong 1 giờ.
- Thêm 6 ml mơi trường duy trì tế bào. Ủ ở 370C, 5% CO2 tối đa trong 7 ngày. - Theo dõi tế bào hàng ngày để phát hiện sự huỷ hoại tế bào. Virút nhân lên trong tế bào sẽ được giải phóng ra mơi trường duy trì tế bào.
2.3.9. Xác định hiệu giá virút
Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
- Cho 50 µl đệm PBS vào các giếng từ B1 đến H11 và cột 12 của phiến 96 giếng (cột 12 dùng để làm chứng hồng cầu)
- Cho 100 µl mỗi mẫu vào một giếng từ A1 đến A11. Pha lỗng bậc 2 dịch ni cấy virút bằng cách chuyển 50 µl từ hàng A sang hàng B, thực hiện tương tự đến hàng
- Cho 50 µl hồng cầu gà 0,5% vào mỗi giếng của phiến 96 giếng. Lắc nhẹ phiến, để 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Nhận định kết quả: chứng hồng cầu sẽ lắng xuống tạo thành một giọt tròn ở cột 12. Mẫu âm tính là mẫu có các giếng hồng cầu lắng hồn tồn. Mẫu dương tính là mẫu có hiện tương ngưng kết hồng cầu hồn toàn; hiệu giá virút được xác định là ở độ pha lỗng cuối cùng của virút mà tại đó gây ngưng kết hồng cầu.
Kĩ thuật plaque [50]
+ Chuẩn bị phiến tế bào 24 giếng:
- Chuẩn bị tế bào MDCK trong môi trường phát triển với nồng độ: 5 x 105 tế bào / ml. - Nhỏ 0,5 ml hỗn dịch tế bào trên vào mỗi giếng của phiến 6 giếng. Ủ tế bào ở 370C, 5% CO2 - Theo dõi tế bào trong 24 giờ để có phiến tế bào với độ phủ kín 90% - 100 %.
+ Pha loãng virút:
- Pha loãng virút trong dung dịch PBS hoặc mơi trường DMEM: pha lỗng bậc 10, bắt