Virút cúm mới rg-A/H5N1 được tổng hợp bằng cách chuyển nhiễm hệ thống tám plasmid đã xây dựng vào tế bào 293T nhờ Lipofectamine (Invitrogen). Sau 3 ngày chuyển nhiễm, nước nổi tế bào của mỗi mẫu chuyển nhiễm (chứa virút rg-A/H5N1) được cấy vào 03 trứng gà có phơi 10 ngày tuổi. Sau 48 giờ, dịch niệu trong trứng gà có phơi được thu thập và thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu gà.
Bảng 3.6. Phát hiện virút rg-A/H5N1 tổng hợp từ hệ thống tám plasmid thông qua khả năng ngưng kết hồng cầu.
Mẫu Virút tổng hợp Khả năng ngƣng kết
hồng cầu của virút
Chứng dƣơng (A/PR/8/34) Trứng 1 HA≥ 128 Trứng 2 HA=64 Trứng 3 HA=64 rg-A/H5N1 Trứng 1 HA (-) Trứng 2 HA=2 Trứng 3 HA (-)
Tương tự trong quá trình đánh giá chức năng mỗi plasmid của hệ chuyển nhiễm, chúng tôi sử dụng hệ thống chuyển nhiễm thiết kế cho virút A/PR/8/34 (H1N1) trong plasmid pHW2000 làm chuẩn (chứng dương). Trong thí nghiệm này, virút cúm rg- A/PR/8/34 được tổng hợp thành công và đạt hiệu giá tối thiểu 64 khi khuếch đại trực tiếp trên trứng gà có phơi 10 ngày tuổi.
Trong cùng điểu kiện chuyển nhiễm, so với virút rg A/PR/8/34 chuẩn, vi rút rg-A/H5N1 cũng được tổng hợp thành công bằng hệ chuyển nhiễm xây dựng trong nghiên cứu và đạt hiệu giá HA=2 (trứng số 2).
đạt từ 64 đến ≥128 trong toàn bộ 3 cá thể trứng (100%), trong khi virút rg-A/H5N1 chỉ được khuếch đại thành công trên 1 cá thể trứng (33,3%) và đạt hiệu giá HA=2. Như vậy, virút rg-A/H5N1 mới tổng hợp thể hiện khả năng thích ứng và khuếch đại cịn hạn chế trong trứng gà có phơi.
Khả năng khuếch đại và đạt hiệu giá HA cao trong vật chủ cảm nhiễm (trứng gà có phơi, tế bào MDCK) phụ thuộc vào đặc tính của từng phân típ của virút cúm, đặc biệt là thụ cảm thể của virút với tế bào cảm nhiễm. Thụ cảm thể của virút cúm được xác định bởi một số axit amin trên protein HA và tạo ra sự tương thích với thụ cảm thể axit sialic của tế bào chủ. Virút cúm người thường có xu hướng gắn bám vào thụ cảm thể alpha 2,6 (SA α 2,6Gal) trong khi virút cúm gia cầm lại thích hợp kiểu alpha 2,3
(SA α 2,3Gal). Trong nghiên cứu của Ito, T. và cs năm 1997, trong trứng gà có phơi, thụ cảm thể SA α 2,3Gal được phát hiện trong cả 2 loại tế bào túi niệu (allatoic) và màng ối (amniotic) trong khi thụ cảm thể SA α 2,6Gal chỉ phát hiện trên tế bào màng ối [22]. Virút cúm rg-A/H5N1 mang protein HA của virút cúm gia cầm A/H5N1 vì vậy sẽ tương thích với kiểu thụ cảm thể SA α 2,3Gal trong tế bào chủ. Tuy nhiên, kết quả trong nghiên cứu sau một lần khuếch đại chỉ đạt hiệu quả 33,3% và hiệu giá HA thấp (HA=2), trong khi với virút rg-A/PR/8/34 đạt hiệu quả 100% và hiệu giá HA ≥128. Sự khác biệt này có thể giải thích do virút rg-A/H5N1 được tích hợp từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2, vì vậy virút mới khơng thuần chủng như A/PR/8/34 cho nên sự phối hợp trong q trình thích nghi, sao chép và khuếch đại trong tế bào cảm nhiễm chưa thuần thục vì vậy kết quả thu được hạn chế. Khả năng thích ứng của virút rg-A/H5N1 có thể cải thiện nếu tiếp tục khuếch đại nhiều lần trên trứng gà có phơi. Ngồi ra, sự có mặt trong 6 gen của virút cúm người A/H3N2 trong virút rg-A/H5N1cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng sao chép và khuếch đại của virút này khi tỷ lệ phân lập virút cúm A/H3N2 trên trứng gà có phơi chỉ đạt từ 0-7,6% trong khi tỷ lệ này có thể đạt từ 58,0% -71,0% khi tiến hành phân lập trên tế bào cảm nhiễm MDCK [35].
Tuy kết quả thu được trong nghiên cứu còn khiêm tốn nhưng đã khẳng định hệ thống chuyển nhiễm plasmid đã xây dựng cho phép tổng hợp thành cơng virút cúm có các phân đoạn gen của virút cúm gia cầm A/H5N1 và virút cúm người A/H3N2 lưu hành tại Việt nam. Virút mới rg-A/H5N1 mang đặc tính cơ bản của virút cúm đó là khả năng nhân lên trong vật chủ cảm nhiễm và gây ngưng kết với hồng cầu gà.
3.1.4.2. Hệ gen của virút cúm rg-A/H5N1.
Xác định thành phần hệ gen của virút cúm rg-A/H5N1 để xác định mức độ chính xác của quá trình thực hiện chuyển nhiễm plasmid tạo virút. Virút rg-A/H5N1 được xác định trình tự nucleotide của tám phân đoạn gen rồi so sánh với trình tự tám đoạn ADN đích. Q trình giải trình tự này sử dụng hệ thống mồi bảng 2.2. Virút rg- A/H5N1 được tổng hợp từ hệ thống plasmid do đó trước khi tiến hành giải trình tự, mẫu ARN tách chiết từ virút rg-A/H5N1 được kiểm tra sự tồn dư của ADN plasmid trong mẫu.
Độ tinh sạch của mẫu ARN tách chiết từ virút rg-H5N1/H3N2
Thực hiện đồng thời PCR và RT-PCR với cùng một cặp mồi, khuôn là ARN tách chiết từ virút rg-A/H5N1, mức độ tinh sạch của mẫu ARN được nhận định như bảng 3.7.
Bảng 3.7. Mức độ tinh sạch mẫu ARN của virút rg-A/H5N1
Kết quả PCR Kết quả RT-PCR Thành phần mẫu tách chiết ADN plasmid ARN virút
1 Âm tính Âm tính Khơng Khơng
2 Dương tính Dương tính Có Có hoặc khơng
Sử dụng cặp mồi chẩn đoán virút cúm A/H5 để thực hiện phản ứng PCR và RT- PCR, chúng tôi thu được kết quả như sau:
rg E1: virút rg-A/H5N1 PC: chứng dương
Hình 3.8. Kiểm tra mức độ tinh sạch mẫu ARN của virút rg-A/H5N1
Kết quả hình 3.8 cho thấy mẫu ARN tách chiết từ virút rg-A/H5N1 không bị tạp nhiễm với ADN plasmid, hoặc nếu có thì lượng ADN plasmid khơng đủ để phát hiện được bằng phương pháp PCR và RT-PCR. Mẫu tách chiết ARN này đủ độ tin cậy dùng làm khn cho q trình giải trình tự các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1.
Hệ gen của virút rg-A/H5N1
Tám phân đoạn gen của virútrg-A/H5N1 được tiến hành giải trình tự chuỗi tương tự như q trình giải trình tự các đoạn ADN đích. Tuy nhiên trong cơng đoạn này, với mỗi phân đoạn gen chúng tơi chỉ giải trình tự một phần vùng mã hóa dài khoảng 400 – 700 nucleotide với mục đích tiết kiệm thời gian và nguyên vật liệu. Các trình tự chuỗi thu được sẽ được so sánh với trình tự ADN đích trong hệ thống chuyển nhiễm để xác định nguồn gốc các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1.
Bảng 3.8. Nguồn gốc các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1
Virút rg-A/H5N1 Hệ thống chuyển nhiễm
Số nucleotide sai khác Phân đoạn Vùng giải trình tự ADN đích Vị trí (5’-3’) Chiều dài (bp) NS 30-619 590 NS (A/Hanoi/N062/2007) 0 M 30-649 620 M (A/Hanoi/N062/2007) 0 NP 30-509 480 NP (A/Hanoi/N062/2007) 0 PA 30-609 580 PA (A/Hanoi/N062/2007) 0 PB1 30-459 430 PB1 (A/Hanoi/N062/2007) 1 PB2 30-509 480 PB2 (A/Hanoi/N062/2007) 1 HA 30-619 590 HA (A/Vietnam/1203/2004) 1 NA 30-659 630 NA (A/Vietnam/1203/2004) 0
Bảng 3.8 cho thấy các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1 tương ứng với các đoạn ADN của hệ thống chuyển nhiễm đó là các phân đoạn NS, M, NP, PA, PB1, PB2 của virút A/Hanoi/N062/2007 (H3N2) và phân đoạn HA, NA của virút A/Vietnam/1203/2004 (H5N1). Sự khác biệt 1 nucleotide trên vùng so sánh của các phân đoạn PB1, PB2 và HA virút rg-A/H5N1 tuy khơng có nhiều ý nghĩa trong nghiên cứu này nhưng cũng là điểm cần lưu ý. Khả năng thích ứng của virút cúm trên trứng gà có phơi sau nhiều lần cấy chuyển có thể tạo ra nhiều đột biến và kết quả là sự thay đổi đặc tính kháng nguyên cũng như thụ cảm thể bám của virút cúm [47].
Thành phần hệ gen của virút rg-A/H5N1 thu được theo đúng thiết kế của hệ thống chuyển nhiễm đã xây dựng trong nghiên cứu, khẳng định sự lựa chọn quy trình cũng như nguyên vật liệu cho nghiên cứu là phù hợp và đúng mục đích.
Sự thành cơng của việc xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid tổng hợp virút cúm gia cầm-người trong nghiên cứu này cho phép phát triển và thiết kế các hệ thống chuyển nhiễm plasmid khác trên cơ sở các virút cúm lưu hành trên người và động vật tại Việt Nam. Từ đó, phát triển các nghiên cứu về dự báo sự tiến hóa, độc lực, khả năng xuất hiện virút đại dịch cũng như phát triển vaccine phịng bệnh cho tương lai.
3.2. Tìm hiểu đặc tính của virút cúm rg-A/H5N1 (gia cầm – ngƣời)
Q trình này được thực hiện trong Phịng thí nghiệm An tồn sinh học cấp độ III, Khoa An tồn sinh học và Quản lí chất lượng, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
Virút rg-A/H5N1 được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược có khả năng ngưng kết với hồng cầu gà thấp (HA = 2) (bảng 3.6). Kết quả trên có thể do sự thích nghi hạn chế của virút với vật chủ cảm nhiễm (trứng gà có phơi) hoặc do sự phối hợp chưa thuần thục của các phân đoạn gen trong quá trình sao chép. Vì vậy chúng tơi tiến hành các thử nghiệm tiếp để xác định chính xác đặc tính của virút mới này và tạo các virút có hiệu giá cao thích hợp, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp sau.
3.2.1. Khả năng thích ứng của virút rg-A/H5N1 với tế bào MDCK và trứng gà có phơi.
Dựa vào cấu trúc của các tế bào cảm nhiễm đã biết cũng như đặc tính bám của virút cúm người và virút cúm gia cầm, chúng tôi lựa chọn trứng gà có phơi 10 ngày tuổi và tế bào thận chó MDCK để tiến hành thử nghiệm xác định điều kiện tối ưu cho q trình thích nghi, sao chép và khuếch đại virút rg-A/H5N1.
Thử nghiệm này được tiến hành đồng thời với các virút gốc (bố, mẹ) đó là A/Hanoi/N062/2007 (H3N2) và A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) trong cùng điều kiện
nhiệt độ (330C và 370C) và trên cùng hệ thống cảm nhiễm (trứng gà có phơi 10 ngày tuổi và tế bào thận chó MDCK)
Bảng 3.9. Hiệu giá (HA) virút rg-A/H5N1 khuếch đại trên tế bào MDCK và trứng gà có phơi. Nhiệt độ Chủng virút Tế bào MDCK Trứng gà có phơi D1 D2 D3 D4 D5 D1 D2 D3 330C N062 (H3N2) (-) (-) 4 4 32 (-) (-) (-) VN1203 (H5N1) (-) 2 4 16 64 2 128 rg-A/H5N1 (-) 1 2 8 32 (rg-1) 16 128 (rg-2) 370C N062 (H3N2) (-) (-) 4 4 32 (-) (-) (-) VN1203 (H5N1) (-) 8 32 64 8 128 rg-A/H5N1 (-) 1 4 8 32 (rg-3) 16 128 (rg-4)
D1 – D5: ngày 1 – ngày 5 sau phân lập virút N062: Virút A/Hanoi/N062/2007
a. Trứng gà có phơi
b. Tế bào MDCK
Hình 3.9. Khả năng nhân lên của virút rg-A/H5N1 trong hệ thống cảm nhiễm. 0 0 16 32 48 64 80 96 112 128 D1 D2 D3 D4 D5 D1 D2 D3 D4 D5 33 độ C 37 độ C N062 (H3N2) VN1203 (H5N1) rgA/H3N2-H5N1 0 10 20 30 40 50 60 70 D1 D2 D3 D4 D5 D1 D2 D3 D4 D5 33 độ C 37 độ C N062 (H3N2) VN1203 (H5N1) rgA/H3N2-H5N1
Bảng 3.9 và hình 3.9 cho thấy, tại nhiệt độ 370C, virút cúm gia cầm gốc A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) có khả năng nhân lên tốt trên cả hai hệ thống cảm nhiễm trứng gà có phơi và tế bào MDCK, đạt hiệu giá HA ≥128 trên trứng gà có phơi. Tại nhiệt độ 330C, virút cúm gia cầm gốc tuy vẫn đạt hiệu giá HA=64 trên tế bào MDCK nhưng thời gian kéo dài hơn (5 ngày) so với ở điểu kiện 370
C (4 ngày).
Virút cúm người gốc A/Hanoi/N062/2004 (H3N2) chỉ có khả năng nhân lên trên tế bào MDCK (bảng 3.9) và đạt hiệu giá HA=32 trong cả 2 điều kiện nhiệt độ (330C và 370C).
Virút cúm rg-A/H5N1: đạt hiệu giá HA=32 tại ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm trên tế bào MDCK; đạt hiệu giá HA=128 trên trứng gà có phơi; khơng có sự ảnh hưởng bởi điều kiện nhiệt độ đối với quá trình khuếch đại trong cả hai hệ thống cảm nhiễm.
Kết quả trên cho thấy, virút rg-A/H5N1 đã thừa hưởng được sự đa dạng về vật chủ cảm nhiễm của virút cúm gia cầm (A/H5N1), tuy nhiệt độ 330C khơng thích hợp khuếch đại nhanh, nhưng vẫn đạt hiệu quả tốt khi thời gian gây nhiễm kéo dài (5 ngày). Như vậy, khả năng trao đổi và tích hợp di truyền giữa virút cúm gia cầm A/H5N1 và A/H3N2 hình thành virut cúm gia cầm – người trong tự nhiên là có thể. Q trình nhân lên của virút này trên tế bào biểu mô trên đường hô hấp trên (330C) sẽ hiệu quả nếu thời gian nhiễm kéo dài, và sự lây truyền của virút cúm này thơng qua các hạt khí dung (aerosol) sẽ là mối nguy hiểm cho sức khỏe cộng đồng.
3.2.2. Định lượng virút rg-A/H5N1 bằng kỹ thuật plaque (tạo đám hoại tử).
Sau khi khuếch đại trên tế bào MDCK và trứng gà có phơi, nhằm xác định tính ổn định (độ thuần chủng) của virút rg-A/H5N1 và định lượng nồng độ của các virút gây nhiễm này, chúng tôi tiến hành thực hiện kỹ thuật plaque.
Lựa chọn virút rg-3 và rg-4 cho thử nghiệm này trên cơ sở hai virút này được
khuếch đại tại nhiệt độ 370C tương đương với nhiệt độ thiết kế cho phản ứng plaque. Bảng 3.10. Định lượng virút rg-3 và rg-4 bằng kĩ thuật plaque.
Độ pha lỗng virút
Số plaque trung bình / 100 µl rg-3 (E1M1) (HA = 32) rg-4 (E2) (HA ≥128) 10-2 n 10-3 n 10-4 n n 10-5 3,3 n 10-6 1 n 10-7 0 8,7 10-8 9,3 10-9 3 Hiệu giá (PFU/ml) 10 7 1010,48
(n): không thể xác định được số lượng plaque.
PFU: đơn vị hình thành plaque (plaque-forming unit)
Kết quả cho thấy plaque tạo ra bởi virút rg-3 (E1M1) và rg-4 (E2) khơng có sự khác biệt về hình dạng và kích cỡ. Các plaque có dạng hình trịn, đường kính 2-3mm. Hiệu giá của virút rg-3 (E1M1) được xác định là 107 PFU/ml, của virút rg-4 (E2) được xác định là 1010,48
PFU/ml (phụ lục 10).
Như vậy, chủng rg-A/H5N1, có 2 đoạn gen của A/H5N1 (cúm gia cầm) và 6 đoạn gen của A/H3N2 (cúm người) có khả năng thích ứng với cả hai hệ thống cảm
nhiễm là tế bào MDCK và trứng gà có phơi, trong đó trứng gà có phơi cho hiệu giá virút cao hơn (với cả phương pháp ngưng kết hồng cầu và kĩ thuật plaque).
3.2.3. Khả năng gây bệnh của virút cúm rg-A/H5N1 trên động vật thí nghiệm
Với mục đích tìm hiểu độc tính của virút cúm mới rg-A/H5N1 và so sánh với độc tính của virút A/H5N1 gốc là A/Vietnam/1203/2004, chúng tơi tiến hành thí nghiệm xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm, LD50 (Lethal dose 50%), của virút rg-A/H5N1 trên chuột nhắt Swiss. Virút được sử dụng cho thí nghiệm này là rg- A/H5N1 (E2) (rg-4). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.11
Bảng 3.11. Kết quả thí nghiệm xác định LD50 của virút rg-4 trên chuột Swiss.
Lơ thí nghiệm Virút gây nhiễm
(PFU/ml) Số cá thể chết Số cá thể sống 1 103 2 3 2 102 2 3 3 101 3 2 4 100 2 3 5 10-1 2 3
6 (đối chứng) Không gây nhiễm (0) (5)
Từ kết quả bảng 3.11, sử dụng phương pháp Reed-Muench xác định giá trị LD50 của virút rg-4 là 101,75 PFU/ml (phụ lục 11). So với giá trị LD50 của virút A/Vietnam/1203/2004 là 102,5 PFU/ml (kết quả nghiên cứu của PTN Cúm năm 2011),
nhiên, sự khác nhau về giá trị LD50 có thể là do sự khác nhau về động vật thí nghiệm: trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chuột Swiss trong khi chuột balb/c được sử dụng cho virút A/Vietnam/1203/2004. Do đó, cần nghiên cứu thêm về khả năng nhân lên của virút rg-4 ở biểu mô đường hô hấp trên và hô hấp dưới cũng như ở một số cơ quan khác của động vật thí nghiệm.
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi xin đưa ra những kết luận sau:
1. Đã xây dựng được hệ thống chuyển nhiễm gồm tám plasmid có khả năng tổng hợp virút cúm A.
2. Đã tổng hợp được virút cúm mới rg-A/H5N1 từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngược.
3. Một vài đặc tính của virút cúm mới rg-A/H5N1 (cúm gia cầm – người) - Mang đặc điểm kháng nguyên của virút cúm gia cầm A/H5N1.
- Có khả năng thích ứng với cả hai hệ thống cảm nhiễm là tế bào MDCK và trứng gà có phơi 10 ngày tuổi ở cả 2 điều kiện nhiệt độ 330C (thích hợp với virút cúm