0 16 32 48 64 80 96 112 128 D1 D2 D3 D4 D5 D1 D2 D3 D4 D5 33 độ C 37 độ C N062 (H3N2) VN1203 (H5N1) rgA/H3N2-H5N1 0 10 20 30 40 50 60 70 D1 D2 D3 D4 D5 D1 D2 D3 D4 D5 33 độ C 37 độ C N062 (H3N2) VN1203 (H5N1) rgA/H3N2-H5N1
Bảng 3.9 và hình 3.9 cho thấy, tại nhiệt độ 370C, virút cúm gia cầm gốc A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) có khả năng nhân lên tốt trên cả hai hệ thống cảm nhiễm trứng gà có phơi và tế bào MDCK, đạt hiệu giá HA ≥128 trên trứng gà có phơi. Tại nhiệt độ 330C, virút cúm gia cầm gốc tuy vẫn đạt hiệu giá HA=64 trên tế bào MDCK nhưng thời gian kéo dài hơn (5 ngày) so với ở điểu kiện 370
C (4 ngày).
Virút cúm người gốc A/Hanoi/N062/2004 (H3N2) chỉ có khả năng nhân lên trên tế bào MDCK (bảng 3.9) và đạt hiệu giá HA=32 trong cả 2 điều kiện nhiệt độ (330C và 370C).
Virút cúm rg-A/H5N1: đạt hiệu giá HA=32 tại ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm trên tế bào MDCK; đạt hiệu giá HA=128 trên trứng gà có phơi; khơng có sự ảnh hưởng bởi điều kiện nhiệt độ đối với quá trình khuếch đại trong cả hai hệ thống cảm nhiễm.
Kết quả trên cho thấy, virút rg-A/H5N1 đã thừa hưởng được sự đa dạng về vật chủ cảm nhiễm của virút cúm gia cầm (A/H5N1), tuy nhiệt độ 330C khơng thích hợp khuếch đại nhanh, nhưng vẫn đạt hiệu quả tốt khi thời gian gây nhiễm kéo dài (5 ngày). Như vậy, khả năng trao đổi và tích hợp di truyền giữa virút cúm gia cầm A/H5N1 và A/H3N2 hình thành virut cúm gia cầm – người trong tự nhiên là có thể. Q trình nhân lên của virút này trên tế bào biểu mô trên đường hô hấp trên (330C) sẽ hiệu quả nếu thời gian nhiễm kéo dài, và sự lây truyền của virút cúm này thông qua các hạt khí dung (aerosol) sẽ là mối nguy hiểm cho sức khỏe cộng đồng.
3.2.2. Định lượng virút rg-A/H5N1 bằng kỹ thuật plaque (tạo đám hoại tử).
Sau khi khuếch đại trên tế bào MDCK và trứng gà có phơi, nhằm xác định tính ổn định (độ thuần chủng) của virút rg-A/H5N1 và định lượng nồng độ của các virút gây nhiễm này, chúng tôi tiến hành thực hiện kỹ thuật plaque.
Lựa chọn virút rg-3 và rg-4 cho thử nghiệm này trên cơ sở hai virút này được
khuếch đại tại nhiệt độ 370C tương đương với nhiệt độ thiết kế cho phản ứng plaque. Bảng 3.10. Định lượng virút rg-3 và rg-4 bằng kĩ thuật plaque.
Độ pha loãng virút
Số plaque trung bình / 100 µl rg-3 (E1M1) (HA = 32) rg-4 (E2) (HA ≥128) 10-2 n 10-3 n 10-4 n n 10-5 3,3 n 10-6 1 n 10-7 0 8,7 10-8 9,3 10-9 3 Hiệu giá (PFU/ml) 10 7 1010,48
(n): không thể xác định được số lượng plaque.
PFU: đơn vị hình thành plaque (plaque-forming unit)
Kết quả cho thấy plaque tạo ra bởi virút rg-3 (E1M1) và rg-4 (E2) khơng có sự khác biệt về hình dạng và kích cỡ. Các plaque có dạng hình trịn, đường kính 2-3mm. Hiệu giá của virút rg-3 (E1M1) được xác định là 107 PFU/ml, của virút rg-4 (E2) được xác định là 1010,48
PFU/ml (phụ lục 10).
Như vậy, chủng rg-A/H5N1, có 2 đoạn gen của A/H5N1 (cúm gia cầm) và 6 đoạn gen của A/H3N2 (cúm người) có khả năng thích ứng với cả hai hệ thống cảm
nhiễm là tế bào MDCK và trứng gà có phơi, trong đó trứng gà có phơi cho hiệu giá virút cao hơn (với cả phương pháp ngưng kết hồng cầu và kĩ thuật plaque).
3.2.3. Khả năng gây bệnh của virút cúm rg-A/H5N1 trên động vật thí nghiệm
Với mục đích tìm hiểu độc tính của virút cúm mới rg-A/H5N1 và so sánh với độc tính của virút A/H5N1 gốc là A/Vietnam/1203/2004, chúng tơi tiến hành thí nghiệm xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm, LD50 (Lethal dose 50%), của virút rg-A/H5N1 trên chuột nhắt Swiss. Virút được sử dụng cho thí nghiệm này là rg- A/H5N1 (E2) (rg-4). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.11
Bảng 3.11. Kết quả thí nghiệm xác định LD50 của virút rg-4 trên chuột Swiss.
Lơ thí nghiệm Virút gây nhiễm
(PFU/ml) Số cá thể chết Số cá thể sống 1 103 2 3 2 102 2 3 3 101 3 2 4 100 2 3 5 10-1 2 3
6 (đối chứng) Không gây nhiễm (0) (5)
Từ kết quả bảng 3.11, sử dụng phương pháp Reed-Muench xác định giá trị LD50 của virút rg-4 là 101,75 PFU/ml (phụ lục 11). So với giá trị LD50 của virút A/Vietnam/1203/2004 là 102,5 PFU/ml (kết quả nghiên cứu của PTN Cúm năm 2011),
nhiên, sự khác nhau về giá trị LD50 có thể là do sự khác nhau về động vật thí nghiệm: trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chuột Swiss trong khi chuột balb/c được sử dụng cho virút A/Vietnam/1203/2004. Do đó, cần nghiên cứu thêm về khả năng nhân lên của virút rg-4 ở biểu mô đường hô hấp trên và hô hấp dưới cũng như ở một số cơ quan khác của động vật thí nghiệm.
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi xin đưa ra những kết luận sau:
1. Đã xây dựng được hệ thống chuyển nhiễm gồm tám plasmid có khả năng tổng hợp virút cúm A.
2. Đã tổng hợp được virút cúm mới rg-A/H5N1 từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngược.
3. Một vài đặc tính của virút cúm mới rg-A/H5N1 (cúm gia cầm – người) - Mang đặc điểm kháng nguyên của virút cúm gia cầm A/H5N1.
- Có khả năng thích ứng với cả hai hệ thống cảm nhiễm là tế bào MDCK và trứng gà có phơi 10 ngày tuổi ở cả 2 điều kiện nhiệt độ 330C (thích hợp với virút cúm người) và 370
C (thích hợp với virút cúm gia cầm). - Có khả năng lây nhiễm:
Hiệu giá ngưng kết hồng cầu: 32 HAU (tế bào MDCK) và 128 HAU (trứng gà có phơi 10 ngày tuổi).
Hiệu giá tạo đám hoại tử (plaque): 107 PFU/ml (virut khuếch đại trên trứng gà có phơi 10 ngày tuổi) và 1010,48 PFU/ml (virut khuếch đại trên tế bào MDCK).
ĐỀ XUẤT
Bên cạnh những mục tiêu nghiên cứu đã đạt được, chúng tôi xin có những đề xuất sau:
1. Hệ thống chuyển nhiễm tạo virút cúm A sử dụng trong nghiên cứu có thể được áp dụng để thiết kế các hệ thống chuyển nhiễm tạo virút cúm A khác từ các virút cúm đang lưu hành trên người.
2. Tiếp tục phát triển các nghiên cứu về khả năng gây bệnh, độc lực, khả năng đáp ứng với thuốc kháng virút của virút rg-A/H5N1 để hiểu rõ các đặc điểm virút học cũng như những biện pháp dự phòng và điều trị phù hợp đối với những virút có đặc tính tương tự.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Lê Khánh Hằng (2010), "Nghiên cứu căn nguyên của các vụ dịch cúm người đầu những năm 2000 tại miền Bắc Việt Nam", Luận án Tiến sĩ Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
2. Nguyễn Trần Hiển và cs (2012), "Cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam", Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
3. Phạm Văn Ty (2007), "Virut học", Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.
Tiếng Anh
4. 1. H5N1 Influenza Virus Vaccine, A/Vietnam/1203/2004 (Clade 1):
http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/07/briefing/2007-4282B1_01.pdf.
5. Acheson, N.H. (2007), "Orthomyxoviruses" Fundamentals of Molecµlar Virology, pp. 248–260.
6. Bouback, T.A.F. and Redwan, N.A. (2011), "Approaches toward the development of DNA vaccine for influenza virus", Afr. J. Biotechnol., 10(26),
pp. 5209–5218.
7. Changa, L.Y. et al. (2009), "Novel Swine-origin Influenza Virus A (H1N1): The First Pandemic of the 21st Century", Journal of the Formosan Medical Association, 108(7), pp. 526–532.
8. Chen W, Calvo PA, Malide D, Gibbs J, Schubert U, Bacik I, Basta S, O’Neill R, Schickli J, Palese P, Henklein P, Bennink JR, Y.J. (2001), "A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death.", Nat Med., 7(12), pp. 1306–
12.
9. Coleman, J.R. (2007), "The PB1-F2 protein of Influenza A virus: increasing pathogenicity by disrupting alveolar macrophages.", Virology journal, 4(1), pp.
11. Cross, K.J. et al. (2001), "Mechanisms of cell entry by influenza virus.", Expert reviews in molecµlar medicine, 3(21), pp. 1–18.
12. Cumµlative Number H5N1 cases:
http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/EN_GIP_20120810Cum µlativeNumberH5N1cases.pdf.
13. Elton, D. et al. (2001), "Interaction of the Influenza Virus Nucleoprotein with the Cellµlar CRM1-Mediated Nuclear Export Pathway", J. Virol., 75(1), pp. 408–
419.
14. Fang, R. et al. (1981), "Complete structure of A/duck/Ukraine/63 influenza hemagglutinin gene: Animal virus as progenitor of human H3 Hong Kong 1968 influenza hemagglutinin", Cell, 25(2), pp. 315–323.
15. Flu.gov "Pandemic Flu History":
http://www.flu.gov/pandemic/history/index.html#
16. Gabriele Neumann, T.W. et al. (1999), "Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, pp. 9345–9350. 17. Gabriele Neumann, Takeshi Noda, and Y.K. (2010), "Emergence and pandemic
potential of swine-origin H1N1 influenza virus", Nature, 459(7249), pp. 931–
939.
18. Gall, A. et al. (2008), "Universal primer set for amplification and sequencing of HA0 cleavage sites of all influenza A viruses.", Journal of clinical microbiology, 46(8), pp. 2561–7.
19. Hoffmann, E. et al. (2000), "A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids.", Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 97(11), pp. 6108–13.
20. Hutchinson, E.C. et al. (2010), "Genome packaging in influenza A virus.", The Journal of general virology, 91(Pt 2), pp. 313–28.
21. ICTV Virus Taxonomy: 2011 Release (current):
22. Ito, T. et al. (1997), "Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.", Journal of virology, 71(4), pp. 3357–62.
23. Jackson, S. et al. (2009), "Reassortment between avian H5N1 and human H3N2 influenza viruses in ferrets: a public health risk assessment.", Journal of virology, 83(16), pp. 8131–40.
24. Karl G. Nicholson, Robert G. Webster, A.J.H. (1998), "Virus Structure and Replication" Textbook of Influenza, pp. 29–108.
25. Kawaoka Y, S.K. a. W.R. (1989), "Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics", J Virol, 63, pp.
4603–4608.
26. Krumbholz, A. et al. (2011), "Current knowledge on PB1-F2 of influenza A viruses.", Medical microbiology and immunology, 200(2), pp. 69–75.
27. Lambl, R.A. (1983), "THE GENE STRUCTURE AND REPLICATION OF INFLUENZA VIRUS", 52, pp. 467–506.
28. Le, M.T.Q. et al. (2008), "Influenza A H5N1 clade 2.3.4 virus with a different antiviral susceptibility profile replaced clade 1 virus in humans in northern Vietnam.", PloS one, 3(10), pp. e3339.
29. Li, C. et al. (2010), "Reassortment between avian H5N1 and human H3N2 in fluenza viruses creates hybrid viruses with substantial virµlence", PNAS,
107(10), pp. 4687–4692.
30. Li, C. et al. (2010), "Reassortment between avian H5N1 and human H3N2 influenza viruses creates hybrid viruses with substantial virµlence.", Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(10),
pp. 4687–92.
31. Li, D. et al. (2008), "Genetic analysis of influenza A/H3N2 and A/H1N1 viruses circµlating in Vietnam from 2001 to 2006.", Journal of clinical microbiology,
46(2), pp. 399–405.
33. Mccaµley, J.W. and Mahy, B.W.J. (1983), "Structure and function of the influenza virus genome", Biochem.J., 211, pp. 281–294.
34. Medical Microbiology: The Influenza Hush-Bush:
http://varuncnmicro.blogspot.com/2012/05/influenza-hush-bush.html.
35. Minor, P.D. et al. (2009), "Current challenges in implementing cell-derived influenza vaccines: implications for production and regµlation, Jµly 2007, NIBSC, Potters Bar, UK.", Vaccine, 27(22), pp. 2907–13.
36. Nelson, M.I. and Holmes, E.C. (2007), "The evolution of epidemic influenza.",
Nature reviews. Genetics, 8(3), pp. 196–205.
37. Neumann, G. et al. (1997), "Nuclear import and export of influenza virus nucleoprotein.", Journal of virology, 71(12), pp. 9690–700.
38. Nicolson, C. et al. (2005), "Generation of influenza vaccine viruses on Vero cells by reverse genetics: an H5N1 candidate vaccine strain produced under a quality system.", Vaccine, 23(22), pp. 2943–52.
39. Nucleic Acid Purity Assessment Using A260/A280 Ratios:
http://www.biotek.com/resources/articles/nucleic-acid-purity-a260a280.html.
40. Palese, P. et al. (1996), "Negative-strand RNA viruses: genetic engineering and applications.", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(21), pp. 11354–8.
41. Pekosz, A. et al. (1999), "Commentary Reverse genetics of negative-strand RNA viruses: Closing the circle", 96(August), pp. 8804–8806.
42. recommendationvaccine.pdf (application/pdf Object):
http://www.who.int/influenza/resources/documents/recommendationvaccine.pdf.
43. Salahuddin, P. and Khan, A.U. (2010), "Structural and functional analysis of NS1 and NS2 proteins of H1N1 subtype.", Genomics, proteomics & bioinformatics, 8(3), pp. 190–9.
44. Samji, T. (2009), "Influenza A: understanding the viral life cycle.", The Yale journal of biology and medicine, 82(4), pp. 153–9.
45. Shi, H. et al. (2007), "Generation of an attenuated H5N1 avian influenza virus vaccine with all eight genes from avian viruses.", Vaccine, 25(42), pp. 7379–84. 46. Smith, G.J.D. et al. (2009), "Origins and evolutionary genomics of the 2009
swine-origin H1N1 influenza A epidemic.", Nature, 459(7250), pp. 1122–5. 47. Stevens, J. et al. (2010), "Receptor specificity of influenza A H3N2 viruses
isolated in mammalian cells and embryonated chicken eggs.", Journal of virology, 84(16), pp. 8287–99.
48. Subbarao, K. "Application of Reverse Genetics to Influenza Vaccine Development":
http://www.webcomference.com/nihoba/ppt/rac%20safety%20symp_subbarao.p df.
49. Understanding and measuring variations in DNA sample quality:
http://www.ogt.co.uk/resources/literature/483_understanding_and_measuring_v ariations_in_dna_sample_quality.
50. Virus Plaque Assay Protocol (application/pdf Object):
http://www.virapur.com/protocols/Virus Plaque Assay Protocol.pdf.
51. Webby, R.J. et al. (2004), "Responsiveness to a pandemic alert: use of reverse genetics for rapid development of influenza vaccines.", Lancet, 363(9415), pp.
1099–103.
52. Webster RG, W.B., OT Gorman, T.C. and Y.K. (1992), "Evolution and ecology of influenza A viruses", Microbiol. Rev., 56pp. 152–179.
53. WHO (1980), "A revision of the system of nomenclature for influenza viruses: a WHO Memorandum", Bµlletin of the World Health Organization, 58(4), pp.
585–591.
54. Wood, G.W. et al. (1993), "Deduced axit amin sequences at the haemagglutinin cleavage site of avian influenza A viruses of H5 and H7 subtypes.", Archives of virology, 130(1-2), pp. 209–17.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Biên bản cam kết mục đích sử dụng plasmid pHW2000 và hệ thống plasmid chứng dương.
Phụ lục 2. Chi tiết một số quy trình thực hiện trong nghiên cứu
1. Xử lí vector bằng enzyme BsmBI
Thành phần hỗn hợp
Dung dịch đệm 3 (10X) 5 µl
BSA (100X) 0,1 µl
Plasmid (1µg/µl) 1 µl
Enzyme (BsmBI) 1 µl
Nước cất tinh sạch (khơng có nuclease) 42,9 µl
Tổng thể tích 50 µl
Thực hiện 5 phản ứng, lượng plasmid được cắt là 5 µg
Điều kiện nhiệt độ: 550
C trong 4 giờ
2. Xử lí ADN đích bằng enzyme BsmBI / BsaI
Thành phần hỗn hợp
Dung dịch đệm 3 (10X) 5 µl
BSA (100X) 0,1 µl
ADN đích 40 µl
Enzyme (BsmBI/BsaI) 1 – 1,5 µl
Nước cất tinh sạch (khơng có nuclease) vừa đủ
Tổng thể tích 50 µl
Điều kiện nhiệt độ: với BsmBI là 550
3. Tổng hợp ADN bổ trợ (cDNA) Hỗn hợp 1 Hỗn hợp 2 Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl) Mồi Uni12 dNTP ARN 5 1 10 Đệm 5X DTT ARNse Inhibitor Expand RT 5 1 1 1 Tổng 16 Tổng 8
Điều kiện nhiệt cho hỗn hợp 1: 650
C / 5 phút, chuyển lên đá / 2 phút Hỗn hợp 1 + hỗn hợp 2, ủ 430C / 45 phút, 700C / 15 phút. 4. Thực hiện PCR * Thành phần hỗn hợp cho PCR: Thành phần Thể tích (µl) Đệm 5X dNTP
Mồi xi (5pmol) Mồi ngược (5pmol) Enzyme cDNA Nước cất tinh sạch 10 1 2,5 2,5 0,3 3 30,7 Tổng 50
* Quy trình nhiệt cho PCR
Nhiệt độ Thời gian (phút:giây) Số chu kì
940C 2:00 1 940C 570C 680C 0:20 0:30 2:00 / 2:30 35 680C 7:00 1
5. Gắn ADN đích vào plasmid bằng T4 DNA ligase
Thành phần hỗn hợp
Dung dịch đệm (10X) 2 µl
Vector 1,5 µl
ADN đích 3 – 7 µl
Enzyme 3 µl
Nước cất tinh sạch (khơng có nuclease) vừa đủ
Tổng thể tích 20 µl
Phụ lục 3. Kết quả xác định trình tự nucleotide của tám phân đoạn DNA đích
Đoạn PB2 (A/Hanoi/N062/2007)
Đoạn PB1 (A/Hanoi/N062/2007)
Đoạn NP (A/Hanoi/N062/2007)
Đoạn M (A/Hanoi/N062/2007)
Đoạn NS (A/Hanoi/N062/2007)
Đoạn HA (A/Vienam/1203/2004)
Phụ lục 4. Nồng độ ADN đích và vector sau q trình xử lí enzyme. Mẫu đo Nồng độ (ng/µl) Thể tích cần sử dụng (µl) Hàm lượng (ng) pHW2000 đã xử lí 50,1 1,5 75,15 A/Hanoi/N062/20 07 (H3N2) NS 28,4 3 75,2 M 36,3 3 108,9 NP 31,3 4 125,2 PA 26,7 7 186,9 PB1 27,8 7 194,6 PB2 30,7 6 184,2 A/Vietnam/1203/ 2004 (H5N1) NA 40,2 3 120,6 HA 34,5 4,5 155,25
Phụ lục 5. Trình tự nucleotide của tám đoạn ADN đích (chiều dài đủ) trong hệ thống chuyển nhiễm.
Đoạn PB2 (A/Hanoi/N062/2007)
Đoạn PB1 (A/Hanoi/N062/2007)
Đoạn NP (A/Hanoi/N062/2007)
Đoạn M (A/Hanoi/N062/2007)
Đoạn NS (A/Hanoi/N062/2007)
Đoạn HA (A/Vietnam/1203/2004)
Phụ lục 6. Xác định nồng độ và mức độ tinh sạch của plasmid trong hệ thống chuyển nhiễm