Plasmid kiểm tra Virút đƣợc
tổng hợp Khả năng ngƣng kết hồng cầu H ệ th ống chuy ển nhi ễm đư ợc xây d ựng trong nghiên c ứu pHW2000 + N062.NS (1) (+) pHW2000 + N062.M (1) (+) pHW2000 + N062.NP (1) (+) pHW2000 + N062.PA (5) (+) pHW2000 + N062.PB1 (5) (+) pHW2000 + N062.PB2 (5) (+) pHW2000 + VN1203.NA (1) (+) pHW2000 + VN1203.HA (1) (+) Hệ thống plasmid chứng dương (+)
Bảng 3.5 cho thấy tương tự virút A/PR/8/34 được tạo ra từ hệ thống plasmid chứng dương, các virút cúm tạo ra từ một plasmid của hệ thống chuyển nhiễm trong nghiên cứu với bảy plasmid còn lại của hệ thống plasmid chứng dương đều có khả
virút cúm, đồng thời chứng tỏ virút mới có khả năng khuếch đại tốt trên vật chủ cảm nhiễm (trứng gà có phơi). Kết quả này khẳng định mỗi plasmid của hệ thống chuyển nhiễm đều có khả năng tổng hợp vRNA và protein chức năng. Nhận định về sự thay đổi một vài nucleotide trên đoạn ADN nhân dòng trong hệ thống chuyển nhiễm đã không làm thay đổi chức năng protein tương ứng đã được chứng minh.
Kết quả trên khẳng định hệ thống chuyển nhiễm được xây dựng trong nghiên cứu có khả năng tổng hợp virut cúm A.
Kết quả xác định mức độ tương đồng của ADN đích trong hệ thống chuyển nhiễm với ADN đích trước nhân dịng (3.1.3.2 a) cùng với kết quả kiểm tra hoạt động chức năng của mỗi plasmid trong hệ thống chuyển nhiễm (3.1.3.2 b) thể hiện khả năng tổng hợp thành công virút cúm mới rg-A/H5N1 từ hệ thống chuyển nhiễm plasmid mà chúng tôi xây dựng (bảng 3.3).
3.1.4. Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 từ hệ thống chuyển nhiễm plasmid.
Q trình này được thực hiện trong Phịng thí nghiệm An tồn sinh học cấp độ III, Khoa An tồn sinh học và Quản lí chất lượng, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
3.1.4.1.Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1
Virút cúm mới rg-A/H5N1 được tổng hợp bằng cách chuyển nhiễm hệ thống tám plasmid đã xây dựng vào tế bào 293T nhờ Lipofectamine (Invitrogen). Sau 3 ngày chuyển nhiễm, nước nổi tế bào của mỗi mẫu chuyển nhiễm (chứa virút rg-A/H5N1) được cấy vào 03 trứng gà có phơi 10 ngày tuổi. Sau 48 giờ, dịch niệu trong trứng gà có phơi được thu thập và thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu gà.
Bảng 3.6. Phát hiện virút rg-A/H5N1 tổng hợp từ hệ thống tám plasmid thông qua khả năng ngưng kết hồng cầu.
Mẫu Virút tổng hợp Khả năng ngƣng kết
hồng cầu của virút
Chứng dƣơng (A/PR/8/34) Trứng 1 HA≥ 128 Trứng 2 HA=64 Trứng 3 HA=64 rg-A/H5N1 Trứng 1 HA (-) Trứng 2 HA=2 Trứng 3 HA (-)
Tương tự trong quá trình đánh giá chức năng mỗi plasmid của hệ chuyển nhiễm, chúng tôi sử dụng hệ thống chuyển nhiễm thiết kế cho virút A/PR/8/34 (H1N1) trong plasmid pHW2000 làm chuẩn (chứng dương). Trong thí nghiệm này, virút cúm rg- A/PR/8/34 được tổng hợp thành công và đạt hiệu giá tối thiểu 64 khi khuếch đại trực tiếp trên trứng gà có phơi 10 ngày tuổi.
Trong cùng điểu kiện chuyển nhiễm, so với virút rg A/PR/8/34 chuẩn, vi rút rg-A/H5N1 cũng được tổng hợp thành công bằng hệ chuyển nhiễm xây dựng trong nghiên cứu và đạt hiệu giá HA=2 (trứng số 2).
đạt từ 64 đến ≥128 trong toàn bộ 3 cá thể trứng (100%), trong khi virút rg-A/H5N1 chỉ được khuếch đại thành công trên 1 cá thể trứng (33,3%) và đạt hiệu giá HA=2. Như vậy, virút rg-A/H5N1 mới tổng hợp thể hiện khả năng thích ứng và khuếch đại cịn hạn chế trong trứng gà có phơi.
Khả năng khuếch đại và đạt hiệu giá HA cao trong vật chủ cảm nhiễm (trứng gà có phơi, tế bào MDCK) phụ thuộc vào đặc tính của từng phân típ của virút cúm, đặc biệt là thụ cảm thể của virút với tế bào cảm nhiễm. Thụ cảm thể của virút cúm được xác định bởi một số axit amin trên protein HA và tạo ra sự tương thích với thụ cảm thể axit sialic của tế bào chủ. Virút cúm người thường có xu hướng gắn bám vào thụ cảm thể alpha 2,6 (SA α 2,6Gal) trong khi virút cúm gia cầm lại thích hợp kiểu alpha 2,3
(SA α 2,3Gal). Trong nghiên cứu của Ito, T. và cs năm 1997, trong trứng gà có phơi, thụ cảm thể SA α 2,3Gal được phát hiện trong cả 2 loại tế bào túi niệu (allatoic) và màng ối (amniotic) trong khi thụ cảm thể SA α 2,6Gal chỉ phát hiện trên tế bào màng ối [22]. Virút cúm rg-A/H5N1 mang protein HA của virút cúm gia cầm A/H5N1 vì vậy sẽ tương thích với kiểu thụ cảm thể SA α 2,3Gal trong tế bào chủ. Tuy nhiên, kết quả trong nghiên cứu sau một lần khuếch đại chỉ đạt hiệu quả 33,3% và hiệu giá HA thấp (HA=2), trong khi với virút rg-A/PR/8/34 đạt hiệu quả 100% và hiệu giá HA ≥128. Sự khác biệt này có thể giải thích do virút rg-A/H5N1 được tích hợp từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2, vì vậy virút mới khơng thuần chủng như A/PR/8/34 cho nên sự phối hợp trong q trình thích nghi, sao chép và khuếch đại trong tế bào cảm nhiễm chưa thuần thục vì vậy kết quả thu được hạn chế. Khả năng thích ứng của virút rg-A/H5N1 có thể cải thiện nếu tiếp tục khuếch đại nhiều lần trên trứng gà có phơi. Ngồi ra, sự có mặt trong 6 gen của virút cúm người A/H3N2 trong virút rg-A/H5N1cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng sao chép và khuếch đại của virút này khi tỷ lệ phân lập virút cúm A/H3N2 trên trứng gà có phơi chỉ đạt từ 0-7,6% trong khi tỷ lệ này có thể đạt từ 58,0% -71,0% khi tiến hành phân lập trên tế bào cảm nhiễm MDCK [35].
Tuy kết quả thu được trong nghiên cứu còn khiêm tốn nhưng đã khẳng định hệ thống chuyển nhiễm plasmid đã xây dựng cho phép tổng hợp thành cơng virút cúm có các phân đoạn gen của virút cúm gia cầm A/H5N1 và virút cúm người A/H3N2 lưu hành tại Việt nam. Virút mới rg-A/H5N1 mang đặc tính cơ bản của virút cúm đó là khả năng nhân lên trong vật chủ cảm nhiễm và gây ngưng kết với hồng cầu gà.
3.1.4.2. Hệ gen của virút cúm rg-A/H5N1.
Xác định thành phần hệ gen của virút cúm rg-A/H5N1 để xác định mức độ chính xác của quá trình thực hiện chuyển nhiễm plasmid tạo virút. Virút rg-A/H5N1 được xác định trình tự nucleotide của tám phân đoạn gen rồi so sánh với trình tự tám đoạn ADN đích. Q trình giải trình tự này sử dụng hệ thống mồi bảng 2.2. Virút rg- A/H5N1 được tổng hợp từ hệ thống plasmid do đó trước khi tiến hành giải trình tự, mẫu ARN tách chiết từ virút rg-A/H5N1 được kiểm tra sự tồn dư của ADN plasmid trong mẫu.
Độ tinh sạch của mẫu ARN tách chiết từ virút rg-H5N1/H3N2
Thực hiện đồng thời PCR và RT-PCR với cùng một cặp mồi, khuôn là ARN tách chiết từ virút rg-A/H5N1, mức độ tinh sạch của mẫu ARN được nhận định như