3.1. TỔNG HỢP VIRÚT CÚM MỚI TỪ VIRÚT A/H5N1 VÀ A/H3N2
3.1.3.1. Nhân dịng ADN đích
Quy trình nhân dịng ADN đích được thực hiện theo các bước: đưa ADN đích vào pHW2000 (dạng thẳng) để tạo plasmid tái tổ hợp, biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến, sàng lọc và thu nhận plasmid mang ADN đích.
ADN đích được đưa vào plasmid pHW2000 nhờ enzyme nối ADN (T4 DNA ligase). Hàm lượng plasmid và ADN đích trong mỗi phản ứng dung hợp đều đảm bảo yêu cầu của bộ sinh phẩm, được xác định bằng máy đo nanodrop (phụ lục 4). Sau đó, plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli (DH5α-T1) bằng phương
pháp sốc nhiệt. Tế bào vi khuẩn chứa plasmid được xác định bằng cách cấy trải trên môi trường LB thạch. Sau đó, plasmid mang ADN đích được lựa chọn bằng cách tách plasmid rồi so sánh kích thước với mẫu chứng âm và mẫu chứng dương trên gel agarose.
a. Xác định tế bào vi khuẩn nhận plasmid
Tiến hành xác định (nhận dạng) những tế bào vi khuẩn nhận plasmid bằng cách cấy trải trên mơi trường LB thạch có ampicillin.
Đoạn NS Đoạn M Đoạn NP
Đoạn PA Đoạn PB1 Đoạn PB2
a. Virút A/Hanoi/N062/2007
Đoạn HA Đoạn NA
Hình 3.6 cho thấy số lượng khuẩn lạc của các đoạn ADN đích có kích thước lớn hơn 2kb (PB2, PB1, PA) ít hơn đáng kể so với số lượng khuẩn lạc của các đoạn có kích thước nhỏ hơn 2kb (trừ đoạn NA). Như vậy, dường như quá trình nhân dịng các phân đoạn gen của virút cúm phụ thuộc vào kích thước của phân đoạn gen, quá trình này thuận lợi hơn với các đoạn có kích thước nhỏ hơn 2kb (NS, M, NP, HA). Tuy nhiên, đoạn NA lại cho kết quả tương tự như các đoạn PB2, PB1 và PA. Nguyên nhân của hiện tượng này, theo chúng tơi, có thể do sai sót trong q trình xác định hàm lượng đoạn NA vì vậy hiệu quả của q trình nối đoạn NA vào plasmid khơng như các đoạn có kích thước tương tự (NP, HA).
Sự hình thành khuẩn lạc trên mơi trường chọn lọc chứng tỏ tế bào vi khuẩn đã nhận plasmid, có thể là plasmid tái tổ hợp mang ADN đích hoặc plasmid khơng mang ADN đích, phụ thuộc vào q trình xử lí plasmid và q trình tạo vector tái tổ hợp. Vì vậy, khuẩn lạc chứa plasmid mang ADN đích được sàng lọc bằng cách so sánh kích thước với mẫu chứng trên gel agarose.
b. Xác định plasmid mang ADN đích
Lựa chọn đại diện một vài khuẩn lạc để kiểm tra bằng cách nuôi khuẩn lạc trong 3–5ml môi trường LB lỏng rồi tiến hành tách plasmid và so sánh kích thước với plasmid chứng âm và plasmid chứng dương tương ứng trên gel agarose. Plasmid chứng âm là plasmid pHW2000. Hệ thống plasmid chứng dương gồm tám plasmid mang tám đoạn ADN tương ứng với các phân đoạn gen của virút A/PR/8/34 (H1N1). Chọn đại diện 4 khuẩn lạc với các đoạn ADN đích là NS, M, NP, NA; 6 khuẩn lạc với các đoạn kích thước lớn hơn là HA, PA, PB1, PB2 để tiến hành kiểm tra theo quy trình trên.
a.
b.
c.
1-6: khuẩn lạc; PC: chứng dương; NC: chứng âm; M: thang ADN chuẩn 1 kb
Hình 3.7. Kiểm tra kích thước plasmid trên gel agarose
Trong hình 3.7, với các đoạn NS, M, NP, HA và NA, toàn bộ plasmid được kiểm tra đều có kích thước tương tự kích thước chứng dương (hình 3.7 a, c); cịn với
dương cịn có các plasmid có kích thước bằng plasmid chứng âm (hình 3.7b). Plasmid kiểm tra có kích thước bằng chứng dương chứng tỏ là plasmid mang ADN đích, ngược lại plasmid khơng mang ADN đích có kích thước bằng chứng âm.
Bảng 3.2. Kích thước các plasmid được kiểm tra.
Virút ADN đích Plasmid kiểm tra (số thứ tự) Tỉ lệ (%) (+)/(-) 1 2 3 4 5 6 A/Hanoi/N062/2007 (H3N2) NS (+) (+) (+) (+) 100 M (+) (+) (+) (+) 100 NP (+) (+) (+) (+) 100 PA (+) (+) (-) (+) (+) (+) 80,4 PB1 (+) (+) (-) (-) (+) (+) 66,7 PB2 (-) (-) (+) (+) (+) (+) 66,7 A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) HA (+) (+) (+) (+) (+) (+) 100 NA (+) (+) (+) (+) 100
(+):kích thước bằng plasmid chứng dương (-): kích thước bằng plasmid chứng âm
Với các phân đoạn kích thước nhỏ hơn 2 kb (NS, M, NP, HA, NA), toàn bộ số plasmid được kiểm tra đều mang ADN đích (100%); cịn với các đoạn kích thước trên 2 kb, tỉ lệ plasmid mang ADN đích khơng đạt tối đa, cao nhất là 80,4% (PA), thấp nhất là 66,7% (PB1, PB2).
Bên cạnh các khuẩn lạc chứa plasmid mang ADN đích, có một vài khuẩn lạc chỉ chứa plasmid pHW2000 mạch vịng khơng có ADN đích chứng tỏ hoặc hiệu suất hoạt động của enzyme xử lí plasmid hoặc hiệu quả quá trình tạo plasmid tái tổ hợp (nối ADN đích vào pHW2000 dạng thẳng) khơng đạt tối đa (100%) nên vector pHW2000
Tỉ lệ nhân dịng thành cơng trong nghiên cứu này không đạt 100% cho tất cả các phân đoạn gen của virút cúm song kết quả thu được đã chứng tỏ quy trình nhân dịng được lựa chọn trong nghiên cứu phù hợp nên kết quả thu được đủ độ tin cậy để tiến hành các bước tiếp theo. Với mỗi đoạn ADN đích đã thu được tối thiểu 4 plasmid được xác định là mang ADN đích.