Kết quả hình 3.8 cho thấy mẫu ARN tách chiết từ virút rg-A/H5N1 không bị tạp nhiễm với ADN plasmid, hoặc nếu có thì lượng ADN plasmid khơng đủ để phát hiện được bằng phương pháp PCR và RT-PCR. Mẫu tách chiết ARN này đủ độ tin cậy dùng làm khn cho q trình giải trình tự các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1.
Hệ gen của virút rg-A/H5N1
Tám phân đoạn gen của virútrg-A/H5N1 được tiến hành giải trình tự chuỗi tương tự như q trình giải trình tự các đoạn ADN đích. Tuy nhiên trong công đoạn này, với mỗi phân đoạn gen chúng tôi chỉ giải trình tự một phần vùng mã hóa dài khoảng 400 – 700 nucleotide với mục đích tiết kiệm thời gian và nguyên vật liệu. Các trình tự chuỗi thu được sẽ được so sánh với trình tự ADN đích trong hệ thống chuyển nhiễm để xác định nguồn gốc các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1.
Bảng 3.8. Nguồn gốc các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1
Virút rg-A/H5N1 Hệ thống chuyển nhiễm
Số nucleotide sai khác Phân đoạn Vùng giải trình tự ADN đích Vị trí (5’-3’) Chiều dài (bp) NS 30-619 590 NS (A/Hanoi/N062/2007) 0 M 30-649 620 M (A/Hanoi/N062/2007) 0 NP 30-509 480 NP (A/Hanoi/N062/2007) 0 PA 30-609 580 PA (A/Hanoi/N062/2007) 0 PB1 30-459 430 PB1 (A/Hanoi/N062/2007) 1 PB2 30-509 480 PB2 (A/Hanoi/N062/2007) 1 HA 30-619 590 HA (A/Vietnam/1203/2004) 1 NA 30-659 630 NA (A/Vietnam/1203/2004) 0
Bảng 3.8 cho thấy các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1 tương ứng với các đoạn ADN của hệ thống chuyển nhiễm đó là các phân đoạn NS, M, NP, PA, PB1, PB2 của virút A/Hanoi/N062/2007 (H3N2) và phân đoạn HA, NA của virút A/Vietnam/1203/2004 (H5N1). Sự khác biệt 1 nucleotide trên vùng so sánh của các phân đoạn PB1, PB2 và HA virút rg-A/H5N1 tuy khơng có nhiều ý nghĩa trong nghiên cứu này nhưng cũng là điểm cần lưu ý. Khả năng thích ứng của virút cúm trên trứng gà có phơi sau nhiều lần cấy chuyển có thể tạo ra nhiều đột biến và kết quả là sự thay đổi đặc tính kháng nguyên cũng như thụ cảm thể bám của virút cúm [47].
Thành phần hệ gen của virút rg-A/H5N1 thu được theo đúng thiết kế của hệ thống chuyển nhiễm đã xây dựng trong nghiên cứu, khẳng định sự lựa chọn quy trình cũng như nguyên vật liệu cho nghiên cứu là phù hợp và đúng mục đích.
Sự thành công của việc xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid tổng hợp virút cúm gia cầm-người trong nghiên cứu này cho phép phát triển và thiết kế các hệ thống chuyển nhiễm plasmid khác trên cơ sở các virút cúm lưu hành trên người và động vật tại Việt Nam. Từ đó, phát triển các nghiên cứu về dự báo sự tiến hóa, độc lực, khả năng xuất hiện virút đại dịch cũng như phát triển vaccine phịng bệnh cho tương lai.
3.2. Tìm hiểu đặc tính của virút cúm rg-A/H5N1 (gia cầm – ngƣời)
Quá trình này được thực hiện trong Phịng thí nghiệm An tồn sinh học cấp độ III, Khoa An tồn sinh học và Quản lí chất lượng, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
Virút rg-A/H5N1 được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược có khả năng ngưng kết với hồng cầu gà thấp (HA = 2) (bảng 3.6). Kết quả trên có thể do sự thích nghi hạn chế của virút với vật chủ cảm nhiễm (trứng gà có phơi) hoặc do sự phối hợp chưa thuần thục của các phân đoạn gen trong quá trình sao chép. Vì vậy chúng tơi tiến hành các thử nghiệm tiếp để xác định chính xác đặc tính của virút mới này và tạo các virút có hiệu giá cao thích hợp, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp sau.
3.2.1. Khả năng thích ứng của virút rg-A/H5N1 với tế bào MDCK và trứng gà có phơi.
Dựa vào cấu trúc của các tế bào cảm nhiễm đã biết cũng như đặc tính bám của virút cúm người và virút cúm gia cầm, chúng tôi lựa chọn trứng gà có phơi 10 ngày tuổi và tế bào thận chó MDCK để tiến hành thử nghiệm xác định điều kiện tối ưu cho q trình thích nghi, sao chép và khuếch đại virút rg-A/H5N1.
Thử nghiệm này được tiến hành đồng thời với các virút gốc (bố, mẹ) đó là A/Hanoi/N062/2007 (H3N2) và A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) trong cùng điều kiện
nhiệt độ (330C và 370C) và trên cùng hệ thống cảm nhiễm (trứng gà có phơi 10 ngày tuổi và tế bào thận chó MDCK)
Bảng 3.9. Hiệu giá (HA) virút rg-A/H5N1 khuếch đại trên tế bào MDCK và trứng gà có phơi. Nhiệt độ Chủng virút Tế bào MDCK Trứng gà có phơi D1 D2 D3 D4 D5 D1 D2 D3 330C N062 (H3N2) (-) (-) 4 4 32 (-) (-) (-) VN1203 (H5N1) (-) 2 4 16 64 2 128 rg-A/H5N1 (-) 1 2 8 32 (rg-1) 16 128 (rg-2) 370C N062 (H3N2) (-) (-) 4 4 32 (-) (-) (-) VN1203 (H5N1) (-) 8 32 64 8 128 rg-A/H5N1 (-) 1 4 8 32 (rg-3) 16 128 (rg-4)
D1 – D5: ngày 1 – ngày 5 sau phân lập virút N062: Virút A/Hanoi/N062/2007
a. Trứng gà có phơi
b. Tế bào MDCK