STT Vị trí biến đổi Loại biến đổi Thay đổi Axit amin Số lƣợng biến đổi Tần xuất (%) Công bố trên MITOMAP 1 6253 T>C M-T 1 3,7 + 2 6338 A>G L-L 1 3,7 + 3 6340 C>T T-I 1 3,7 + 4 6392 T>C N-N 2 7,4 + 5 6455 C>T F-F 4 14,8 + 6 6515 T>C A-A 2 7,4 + 7 6680 C>T T-T 3 11,1 + 8 6752 A>G V-V 1 3,7 + 9 6884 C>T L-L 1 3,7 + 10 6932 A>G G-G 2 7,4 + 11 6960 C>T L-L 1 3,7 + 12 6962 G>A L-L 3 11,1 + 13 7028 C>T A-A 23 85,2 + 14 7196 C>A L-L 2 7,4 + 15 7250 A>G T-T 1 3,7 + 16 7229 A>G M-V 1 3,7 +
Chú thích: + Biến đổi đã được tìm thấy trên ngân hàng dữ liệu MITOMAP
Bảng 3.1 cho thấy phần lớn các biển đổi xác định ở dạng đồng tế bào chất (13/16). Các dạng biến đổi hay gặp là dạng biến đổi C>T (6/16 trƣờng hợp), tiếp dó A>G (5/16 trƣờng hợp).
Hai mƣơi biến đổi trên gen MT-CO1 ty thể đã đƣợc Ghatak và cs (2014) tìm thấy ở bệnh nhân ung thƣ vú ngƣời Ấn Độ. Hầu hết các biến đổi đều dẫn đến thay đổi những axit amincó tính bảo thủ cao. Hơn nữa, trong các biến đổi làm thay đổi axit amin có biến đổi làm thay đổi cấu trúc bậc 2 của phân tử protein. Họ thấy rằng các biến đổi ở dạng biến đổi sai nghĩa xảy ra ở gen MT-CO1 cao hơn so với các
vùng gen khác trên mtDNA ở bệnh nhân ung thƣ vú ngƣời Ấn độ. Nhƣ vậy, các biến đổi trên MT-CO1 có thể trở thành một chỉ thị sinh học tiềm năng hỗ trợ cho
chuẩn đoán ung thƣ vú [24].
Trên đối tƣợng ung thƣ tuyến tiền liệt, Petrosvà cs nghiên cứu tập trung trên gen MT-CO1 nhận thấy rằng tỷ lệ biến đổi 11-12%,nhiều biến đổi làm thay đổi trình tự axit amin, trong khi đối với nhóm đối chứng <2% có biến đổi gen MT-CO1. Họ
đã phát hiện ba biến đổi sôma ở dạng dị tế bào chất trên gen MT-CO1 làm thay đổi
axit amin có trình tự bảo thủ cao. Biến đổi đầu tiên là G5949A, biến đổi làm thay đổi axit amin glysine (GGA) thành mã kết thúc(AGA). Biến đổi thứ hai T6124C (M74T) tìm thấy ở tế bào mô và máu với chỉ số bảo thủ là 95%, biến đổi thứ 3 là C6924T(A341S), có chỉ số bảo thủ là 100%và biến đổi này thuộc dạng biến đổi khơng hồn tồn ở máu và hồn tồn ở mơ bệnh. Bốn biến đổi dịng mầm trên gen
MT-CO1 ở bệnh nhân ung thƣ tuyến tiền liệt đƣợc tìm thấy nhiều hơn một bệnh
nhân ở mô và máu là T6253C (CI=69%), C6340T (CI=79%), G6261A(CI= 97%), A6663G(CI=95%),các đột biến ở dạng đồng tế bào chất. Do đó, các đột biến trên gen MT-CO1 có thể là một nguyên nhân dẫn đến ung thƣ tuyến tiền liệt [38].
Nhƣ vậy, theo các nghiên cứu đã đƣợc công bố thì số biến đổi trên gen MT- CO1 có ảnh hƣởng đến sự biểu hiệncủa một số bệnh ung thƣ. Vì vậy, phân tích các
biến đổi trên gen MT-CO1 có thể trở thành hƣớng nghiên cứu tiềm năng hỗ trợ cho
3.2. Kết quả sàng lọc biến đổi C6340T, T6253C bằng phƣơng pháp PCR-RFLP 3.2.1. Kết quả thiết kế mồi và lựa chọn enzyme cắt giới hạn 3.2.1. Kết quả thiết kế mồi và lựa chọn enzyme cắt giới hạn
Kết quả đọc trình tự tồn bộ gen MT-CO1 trên 27 bệnh nhân UTĐTT đã xác định đƣợc biến đổi C6340T và T6253C là hai biến đổi sai nghĩavà đột biến dòng mầm trên bệnh ung thƣ tuyến tiền liệt[38]. Vì vậy, chúng tơi tiếp tục sàng lọc hai trị trí biến đổi này bằng phƣơng pháp PCR-RFLP. Kích thƣớc của mồi 5851F- 7595R quá lớn không thể sử dụng cho phƣơng pháp này, nên chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu 6221F-6381R có kích thƣớc 161bp chứa vị trí 6253 và 6340 thuộc gen MT- CO1 và lựa chọn đƣợc hai enzyme giới hạn TaaI và BccI nhận biết vị trí 6253 và
6340 tƣơng ứng (Hình 3.3).
Enzyme TaaI Enzyme BccI
Hình 3.3. Vị trí nhận biết của enzyme
Theo tính tốn lý thuyết, đoạn gen 161bp chứa vị trí biến đổi 6253C sẽ cắt thành 2 đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng: 64bp và 97bp; trong khi đó đoạn gen chứa vị trị khơng biến đổi 6253T cắt thành 3 đoạn: 30bp, 34bp và 97bp.
Tƣơng tự tại 6340C sẽ bị cắt thành 2 đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng là 33bp và 128bp; đoạn gen chứa vị trí biến đổi 6340T sẽ khơng bị cắt và kích thƣớc băng giữ ngun 161bp(Hình 3.3).
3.2.2. Kết quả PCR-RFLP
Kết quả cắt đoạn ADN bằng enzyme BccI
Chúng tôi tiến hành PCR với cặp mồi 6221F-6381R đƣợc thực hiện ở 80 mẫu mô u và 106 mô lân cận ucủa bệnh nhân UTĐTT. Kết quả PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1,5% vàđƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn BccI. Sản phẩm
RFLP đƣợc điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 10%, nhuộm bằng EtBr và quan sát trên máy soi gel.
Chúng tơi tìm thấy ở mơ uxuất hiện 3 mẫu có biến đổi C6340T: 1 biến đổi ở dạng đồng tế bào chất và 2 biến đổi ở dạng dị tế bào chất(bao gồm cả 1 mẫu bệnh nhân giải trình tự có biến đổi này), 3 mẫu biến đổi C6340T trên mô lân cận u tồn tại ở dạng dị tế bào chất. Kết quả cắt bằng enzyme BccI đƣợc minh họa Hình 3.4.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP của mẫu bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng tại vị trí 6340
M: Thang ADN chuẩn 50bp, Giếng (+): Đối chứng dương sản phẩm cắt enzyme (mẫu có biến đổi C6340T được khẳng định bằng giải trình tự), Giếng: (1,2); (3,4);
(5,6): Sản phẩm PCR, cắt enzyme trên mẫu lân cận u, mô u, mẫu máu tương ứng của bệnh nhân #16689, Giếng 7 :Sản phẩm cắt enzyme trên mẫu mô u của bệnh nhân #17401 dạng dị tế bào chất, giếng (-) đối chứng âm sản phẩm PCR được thay
Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP trên Hình 3.4 cho thấy: sản phẩm PCR(1,3,5) có kích thƣớc tƣơng ứng 161bp, các băng rõ, khơng có băng phụ, chứng tỏ cặp mồi(6221F, 6381R) đƣợc thiết kế là đặc hiệu. Sản phẩm cắt enzyme của bệnh nhân #16689 ở giếng 2 cho thấy xuất hiện ba băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 161bp, 128bp và 33bp nên biến đổi ở dạng dị tế bào chất. Ở giếng 4, băng ADN khơng bị cắt, kích thƣớc sản phẩm cắt enzyme bằng sản phẩm PCR, vì vậy đây là dạng biến đổi đồng tế bào chất. Tuy nhiên, giếng 6 khơng có biến đổi nên bị cắt thành hai băng kích thƣớc 128bp và 33bp. Chứng tỏ, kết quả PCR-RFLP của chúng tôi là đáng tin cậy.
Nhƣ vậy biến đổi C6340T xuất hiện ở mô u, lân cận u và không xuất hiện trên mô máu của cùng một bệnh nhân. Trên cơ sở phân tích này chứng tỏ biến đổi C6340T là dạng đột biến sôma trên bệnh nhân UTĐTT. Kết quả này chỉ ra rằng nó khác với nghiên cứu của Petros và cs (2005) vị trí biến đổi C6340T là đột biến dịng mầm[38].
Kết quả cắt đoạn ADN bằng enzyme TaaI
Tƣơng tự nhƣ trên, thực hiện PCR và cắt bằng enzyme TaaI đối với 79 mẫu mơ bệnh nhân UTĐTT. Kết quả phát hiện có 2/106(1,8% tổng số mẫu) mẫu có biến đổi T6253C(bao gồm cả mẫu giải trình tự), hai mẫu đều ở dạng biến đổi đồng tế bào chất. Biến đổi T6253C của hai mẫu ở bệnh nhân #17401 và #9802 đƣợc tìm thấy với giới tính nam và ở vị trí đại tràng, khác nhau về tuổi, giai đoạn bệnh, kích thƣớc khối u.
Tóm lại, bằng phƣơng pháp giải trình tự với kết hợp phƣơng pháp PCR- RFLP, chúng tơi đã phát hiện thấy có ba vị trí biến đổi làm thay đổi axit amin T6253C, C6340T, A7299G. Hiện tại, cả ba biến đổi trên đã đƣợc công bố trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen ty thể. Tuy nhiên, cả ba biến đổi đều chƣa đƣợc công bố trên đối tƣợng bênh nhân UTĐTT. Vì vậy, kết quả của chúng tơi góp phần cung cấp thơng tin về một số biến đổi gen MT-CO1 ở bệnh nhân UTĐTT
3.2.3. Kết quả định lƣợng mức độ đột biến bằng phần mềm ImageJ
Từ những nghiên cứu trƣớc đã chứng minh một số đột biến mtDNA ở dạng dị tế bào chất, mức độ dị tế bào chất liên quan đến biểu hiện lâm sàng và mức độ nặng nhẹ của bệnh ung thƣ[40]. Chúng tôi tiến hành phân tích định lƣợng bằng phần mềm ImageJ cho những mẫu chứa vị trí biến đổi C6340T ở dạng dị tế bào chất.
Để đánh giá mức độ dị tế bào chất, những biến đổi khơng hồn tồn ở mỗi mẫu có xuất hiện C6340T sẽ đƣợc điện di lặp lại trên 2 giếng thuộc cùng một bản gel, thí nghiệm lặp lại hai lần và chụp ảnh (hình 3.5 và 3.6). Điện di sản phẩm cắt ezyme có kèm theo sản phẩm PCR với sựtƣơng đƣơng về lƣợng ADN. Chúng tơi sử dụng hình ảnh để phân tích bằng phần mềm ImageJ.
Kết quả điện di phân tích hình ảnh lần thí nghiệm 1(hình 3.5):
Hình 3.5. Kết quả điện di thí nghiệm lần một trên gel polyacrylamid 10% và phân tích định lƣợng bằng phần mềm ImageJ ở những bệnh nhân
biến đổi khơng hồn tồn tại vị trí 6340
M: Thang ADN chuẩn 50bp. Giếng 1,4,7 là sản phẩm PCR, các giếng (2,3);(5,6);(8,9) là sản phẩm cắt lần lượt của các mẫu #17401LCU; #17401U;
Kết quả điện di và phân tích hình ảnh lần thí nghiệm 2 (hình 3.6):
Hình 3.6. Kết quả điện di thí nghiệm lần 2 trên gel polyacrylamid 10% và phân tích định lƣợng bằng phần mềm Image J ở những bệnh nhân
biến đổi khơng hồn tồn tại vị trí 6340
M: Thang ADN chuẩn 50bp. Các giếng (1,2);(3,4);(5,6) là sản phẩm cắt lần lượt của các mẫu #17401LCU; #17401U; #16689LCU.
Sử dụng phần mềm ImageJ để đo mật độ điểm ảnh:
Băng trƣớc khi cắt enzyme có mật độ điểm ảnh là (a)- tƣơng đƣơng với băng đó kích thƣớc 161bp. Sau khi cắt bằng enzyme trong trƣờng hợp biến đổi khơng hồn tồn gồm các băng: mật độ điểm ảnh (b)- 161bp đại diện cho những bản sao ADN mang biến đổi tại vị trí 6340, mật độ điểm ảnh (c)- 128bp đại diện cho những bản sao ADN khơng mang biến đổi tại vị trí 6340. Nhƣ vậy :
Tỷ lệ % đột biến = (b/b+c)*100(%)
Kết quả phân tích hình ảnh bằng phần mềm Image J với mẫu dị tế bào chất lặp lại hai lần theo Bảng 3.2:
Bảng 3.2. Kết quả xác định mức độ biến đổi C6340T đƣợc phân tích bằng phần mềm ImageJ Mã bệnh nhân Số lần lặp lại Diện tích băng 161bp Diện tích băng 128bp Diện tích băng 33bp Tỷ lệ đột biến 17401 LCU 2 356.33 1842.37 768.07 16.2 17401U 2 3831.49 1687.79 479.19 79.8 16689LCU 2 4806.33 548.59 238.96 89.7
Từ kết quả phân tích Hình 3.5, 3.6 và Bảng 3.2, nhận thấy bệnh nhân #17401 có hiện tƣợng biến đổi khơng hồn tồn cả mơ u và mơ lân cận u. Tuy nhiên, mức độ biến đổi trên mơ u và mơ lân cận u có sự khác biệt rất lớn. Ở mô lân cận u, trên bản gel điện di băng 161bp đại diện cho những bản sao mang biến đổi mờ hơn so với băng 128bp đại diện cho bản sao không mang biến đổi (giếng 2,3 Hình 3.5; giếng 1,2 Hình 3.6). Tính trung bình, tỷ lệ phần trăm dạng 6340T ở bệnh nhân #17401 trên mô lân cận u và mô u tƣơng ứng là 16.2 % và 79.8%. Ở mô lân cận u của bệnh nhân #16689, biến đổi tại vị trí 6340 khơng hồn tồn có tỷ lệ dạng 6340T là 89.7% trong khi đó ở mơ u của bệnh nhân này là dạng biến đổi hoàn toàn(dạng 6340T chiếm 100%). Trên cơ sở phân tích này có thể cho thấy rằng số bản sao ADN ty thể ở dạng 6340T trên mô u cao hơn so với mô lân cận u.
3.3. Kết quả sàng lọc biến đổi C6340T trên mẫu máu của ngƣời bình thƣờng và một vài mẫu máu của ngƣời bệnh một vài mẫu máu của ngƣời bệnh
Tƣơng tự nhƣ sàng lọc đối với bệnh nhân UTĐTT tại vị trí 6340. Chúng tôi tiến hành PCR-RFLP trên 99 mẫu máu ngƣời khỏe mạnh và 9 mẫu máu của bệnh nhân UTĐTT. Kết quả cho thấy 1%(1/99) biến đổi C6340T trên mẫu máu ngƣời khỏe mạnh và khơng có biến đổi C6340T trên mẫu máu của bệnh nhân UTĐTT. Do quá trình thu thập mẫu máu của bệnh nhân UTĐTT gặp khó khăn nên số mẫu đƣợc sàng lọc còn hạn chế. Chúng tôi đã sàng lọc 9 mẫu máu bệnh nhân UTĐTT, tuy nhiên khơng tìm thấy biến đổi C6340T trong cả 9 mẫu đó.
Bàn luận chung
Gen MT-CO1 ty thể mã hóa cho protein cytochrome c oxidase I (MT-CO1)
là tiểu phần thuộc phức hệ hô hấp IV (cytochrome oxidase). Phức hệ hơ hấp IV đóng vai trò tham gia vào quá trình vận chuyển điện tử trong chuỗi hô hấp tế bào[58]. Sự thay đổi cấp độ gen có thể ảnh hƣởng đến chức năng của protein từ đó có thể ảnh hƣởng đến q trình vận chuyển điện tử trong chuỗi hơ hấp ty thể, ảnh hƣởng đến q trình sản xuất năng lƣợng cho tế bào hoặc tăng quá trình phát sinh các gốc tự do từ đó có thể ảnh hƣởng đến sự phát sinh ung thƣ.
Theo thống kê trên cơ sở ngân hàng gen ty thể MITOMAP, cho tới nay có đến 882 vị trí biến đổi trên gen MT-CO1 ty thể bao gồm cả đột biến và đa hình đã đƣợc xác định. Đặc biệt các biến đổi xảy ra ở nhiều loại bệnh khác nhau bao gồm cả ung thƣ, trong đó có UTĐTT. Một số vị trí biến đổi đƣợc xác định là đột biến gây bệnh nhƣ đột biến tại các vị trí G6930A làm thay đổi bộ ba mã hóa cho glycine thành bộ ba mã hóa kết thúc dẫn đến làm mất 170 axit amin cuối cùng (33%) của chuỗi polypeptit do gen MT-CO1[15].
Đối với các bệnh ung thƣ, biến đổi trên gen MT-CO1 cũng đƣợc xác định ở
nhiều dạng ung thƣ khác nhau nhƣ ở ung thƣ tuyến tiền liệt[41], ung thƣ vú[24], ung thƣ đại trực tràng[28]. Một số biến đổi trên gen MT-CO1 có thể làm thay đổi cấu trúc, chức năng protein[41].
Trên đối tƣợng ung thƣ tuyến tiền liệt, biến đổi T6214C tồn tại ở dạng dị tế bào chất, làm thay đổi axit amin trên sản phẩm do gen MT-CO1 mã hóa có thể dẫn đến làm suy yếu quá trình oxy hóa của cytochrome c trong phức hệ IV[13]. Biến đổi T7398C là biến đổi sai nghĩa có thể dẫn đến sự thay đổi chức năng của protein MT-CO1[41].
Trên đối tƣợng bệnh nhân ung thƣ vú, hai biến đổi trên gen MT-CO1:
C6296A và mất nucleotide T tại 6298 đƣợc coi là những yếu tố làm tăng nguy cơ ung thƣ vú[34]. Ngoài ra, các biến đổi ở dạng sai nghĩa xảy ra ở gen MT-CO1 cao hơn so với các vùng gen khác trên mtDNA ở bệnh nhân ung thƣ vú ngƣời Ấn độ.
Nhƣ vậy, các biến đổi trên gen MT-CO1 có thể trở thành một chỉ thị sinh học tiềm năng hỗ trợ cho chuẩn đoán ung thƣ vú[24].
Trong nghiên cứu của Chihara và cs(2011) ở bệnh nhân UTĐTT đã chỉ ra rằng có rất nhiều các biến đổi trên gen ty thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp PCR-RFLP và giải trình tự trực tiếptừ 28 cặp mồi thiết kế nối tiếp nhau. Họ tìm thấy 3 biến đổi trên gen MT-CO1: G6709A, G5973A và A6146G. Trong đó, hai
biến G6709A và G5973A làm thay đổi axit amin. Biến đổi G6709A là biến đổi đồng tế bào chất và làm thay đổi cấu trúc xoắn αcủa protein MT-CO1 thuộc vùng xuyên màng[17].
Cũng trên đối tƣợng UTĐTT, Greaves và cs (2006) đã xác định thấy biến đổi A6277G thuôc gen MT-CO1 ty thể là dạng biến đổi không đồng nghĩa và dẫn đến
sự thay đổi axit amin G125A. Một điều đáng quan tâm là axit amin glycine (G) ở vị trí 125 có tính bảo thủ cao trong q trình tiến hóa nên biến đổi này có khả năng là nguyên nhân của sự thiếu hụt cytochrome c oxidase[28].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng tiến hành sàng lọc các biến đổi trên gen
MT-CO1 bằng phƣơng pháp giải trình tự và PCR-RFLP. Kết quả đã sàng lọc đƣợc
16 biến đổi trong đó có 3 biến đổi làm thay đổi axit amin. Phần lớn các biến đổi (15/16) tồn tại ở dạng đồng tế bào chất với tần suất thấp, chỉ có biến đổi C6340T tồn tại ở dạng dị tế bào chất. Đặc biệt cả ba biến đổi này đều chƣa thấy đƣợc công bố ở đối tƣợng UTĐTT.
Trên cơ sở dữ liệu MITOMAP, khoảng 600 biến đổi đồng nghĩa và 260 biến