Hình A và B: biến đổi C6340T, T6253C của bệnh nhân #17401, Hình C: biến đổi A7299G của bệnh nhân #3753
Hình 3.2 cho thấy các kết quả giải trình tự thu đƣợc các đỉnh rõ ràng, nhƣ vậy kết quả giải trình tự có độ chính xác và tin cậy cao.
Trong 27 mẫu ADN đƣợc giải trình tự, chúng tơi đã sàng lọc đƣợc 16 biến đổi tại các vị trí khác nhau. Nhiều vị trí biến đổi thấy tồn tại cùng trong một mẫu, nhƣmẫu #36924 tìm thấy bốn vị trí biến đổi: T6392C, T6515C, G6962A, C7028T.Theocơ sở dữ liệu ngân hàng gen ty thể MITOMAP, trong số 16 biến đổi thu đƣợccó 3 biến đổi làm thay đổi axit amin và 13 biến đổi ở dạng đồng nghĩa (Bảng 3.1). Một điều đặc biệt là trong số các biến đổi đồng nghĩa, biến đổi C7028T là biến đổi xuất hiện tần suất cao (23/27 mẫu).
Bảng 3.1. Các vị trí biến đổi trên gen MT-CO1 ty thể ở 27 mẫu UTĐTT STT Vị trí STT Vị trí biến đổi Loại biến đổi Thay đổi Axit amin Số lƣợng biến đổi Tần xuất (%) Công bố trên MITOMAP 1 6253 T>C M-T 1 3,7 + 2 6338 A>G L-L 1 3,7 + 3 6340 C>T T-I 1 3,7 + 4 6392 T>C N-N 2 7,4 + 5 6455 C>T F-F 4 14,8 + 6 6515 T>C A-A 2 7,4 + 7 6680 C>T T-T 3 11,1 + 8 6752 A>G V-V 1 3,7 + 9 6884 C>T L-L 1 3,7 + 10 6932 A>G G-G 2 7,4 + 11 6960 C>T L-L 1 3,7 + 12 6962 G>A L-L 3 11,1 + 13 7028 C>T A-A 23 85,2 + 14 7196 C>A L-L 2 7,4 + 15 7250 A>G T-T 1 3,7 + 16 7229 A>G M-V 1 3,7 +
Chú thích: + Biến đổi đã được tìm thấy trên ngân hàng dữ liệu MITOMAP
Bảng 3.1 cho thấy phần lớn các biển đổi xác định ở dạng đồng tế bào chất (13/16). Các dạng biến đổi hay gặp là dạng biến đổi C>T (6/16 trƣờng hợp), tiếp dó A>G (5/16 trƣờng hợp).
Hai mƣơi biến đổi trên gen MT-CO1 ty thể đã đƣợc Ghatak và cs (2014) tìm thấy ở bệnh nhân ung thƣ vú ngƣời Ấn Độ. Hầu hết các biến đổi đều dẫn đến thay đổi những axit amincó tính bảo thủ cao. Hơn nữa, trong các biến đổi làm thay đổi axit amin có biến đổi làm thay đổi cấu trúc bậc 2 của phân tử protein. Họ thấy rằng các biến đổi ở dạng biến đổi sai nghĩa xảy ra ở gen MT-CO1 cao hơn so với các
vùng gen khác trên mtDNA ở bệnh nhân ung thƣ vú ngƣời Ấn độ. Nhƣ vậy, các biến đổi trên MT-CO1 có thể trở thành một chỉ thị sinh học tiềm năng hỗ trợ cho
chuẩn đoán ung thƣ vú [24].
Trên đối tƣợng ung thƣ tuyến tiền liệt, Petrosvà cs nghiên cứu tập trung trên gen MT-CO1 nhận thấy rằng tỷ lệ biến đổi 11-12%,nhiều biến đổi làm thay đổi trình tự axit amin, trong khi đối với nhóm đối chứng <2% có biến đổi gen MT-CO1. Họ
đã phát hiện ba biến đổi sôma ở dạng dị tế bào chất trên gen MT-CO1 làm thay đổi
axit amin có trình tự bảo thủ cao. Biến đổi đầu tiên là G5949A, biến đổi làm thay đổi axit amin glysine (GGA) thành mã kết thúc(AGA). Biến đổi thứ hai T6124C (M74T) tìm thấy ở tế bào mô và máu với chỉ số bảo thủ là 95%, biến đổi thứ 3 là C6924T(A341S), có chỉ số bảo thủ là 100%và biến đổi này thuộc dạng biến đổi khơng hồn tồn ở máu và hồn tồn ở mơ bệnh. Bốn biến đổi dịng mầm trên gen
MT-CO1 ở bệnh nhân ung thƣ tuyến tiền liệt đƣợc tìm thấy nhiều hơn một bệnh
nhân ở mô và máu là T6253C (CI=69%), C6340T (CI=79%), G6261A(CI= 97%), A6663G(CI=95%),các đột biến ở dạng đồng tế bào chất. Do đó, các đột biến trên gen MT-CO1 có thể là một nguyên nhân dẫn đến ung thƣ tuyến tiền liệt [38].
Nhƣ vậy, theo các nghiên cứu đã đƣợc công bố thì số biến đổi trên gen MT- CO1 có ảnh hƣởng đến sự biểu hiệncủa một số bệnh ung thƣ. Vì vậy, phân tích các
biến đổi trên gen MT-CO1 có thể trở thành hƣớng nghiên cứu tiềm năng hỗ trợ cho
3.2. Kết quả sàng lọc biến đổi C6340T, T6253C bằng phƣơng pháp PCR-RFLP 3.2.1. Kết quả thiết kế mồi và lựa chọn enzyme cắt giới hạn 3.2.1. Kết quả thiết kế mồi và lựa chọn enzyme cắt giới hạn
Kết quả đọc trình tự tồn bộ gen MT-CO1 trên 27 bệnh nhân UTĐTT đã xác định đƣợc biến đổi C6340T và T6253C là hai biến đổi sai nghĩavà đột biến dòng mầm trên bệnh ung thƣ tuyến tiền liệt[38]. Vì vậy, chúng tơi tiếp tục sàng lọc hai trị trí biến đổi này bằng phƣơng pháp PCR-RFLP. Kích thƣớc của mồi 5851F- 7595R quá lớn không thể sử dụng cho phƣơng pháp này, nên chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu 6221F-6381R có kích thƣớc 161bp chứa vị trí 6253 và 6340 thuộc gen MT- CO1 và lựa chọn đƣợc hai enzyme giới hạn TaaI và BccI nhận biết vị trí 6253 và
6340 tƣơng ứng (Hình 3.3).
Enzyme TaaI Enzyme BccI