Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.5. Điện di sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn
Điện di là kỹ thuật dùng để phân tách, đôi khi là tinh sạch các đại phân tử mà chủ yếu là axit nucleic và protein trên cơ sở kích thƣớc, khối lƣợng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện đƣợc đặt trong một điện trƣờng, tùy theo điện tích mà chúng sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng hoặc ngƣợc lại. Các axit nucleic mang điện tích âm nên chúng di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích thƣớc phân tử axit nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thƣờng sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào kích thƣớc đoạn ADN muốn phân tách ngƣời ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau.
Điện di trên gel Agarose
Điện di gel agarose đƣợc thực hiện với chất nền là agarose. Nồng độ agarose dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5- 2,5%. Việc hiển thị các băng ADN trong gel agarose sau quá trình chạy điện di đƣợc thực hiện bằng cách nhuộm gel ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) (ủ gel trong dung dịch nhuộm chứa 200-300 ng EtBr/ml khoảng 30 phút) và phát hiện dƣới ánh sáng tử ngoại (UV).
Thành phần gel Agarose chuẩn bị cho kiểm tra sản phẩm PCR đƣợc thể hiện trong Bảng 2.7.
Bảng 2.7. Thành phần gel agarose 1% và 1.5%.
Mục đích
Gel Agarose 1% Gel Agarose 1.5%
Điện di sản phẩm PCR mồi 5851F- 7595R Điện di sản phẩm PCR mồi 6221F- 6381R Thành phần Dung dịch TBE 1X 100ml 100ml Agarose dạng bột 1g 1.5g
Quy trình chuẩn bị gel Agarose và điện di sản phẩm PCR :
- Cân Agarose dạng bột (Invitrogen), bổ sung 100ml đệm chạy TBE 1X pH 8,3 (Tris-base 0,09M; axit boric 0,09M; EDTA 4mM).
- Làm nóng chảy gel bằng cách đun trong lị vi sóng cho đến khi agarose tan hết (khoảng vài phút).
- Làm nguội gel đến khoảng 50-55oC, đổ agarose vào khuôn điện di đã cài lƣợc để tạo giếng.
- Để gel đơng ở nhiệt độ phịng (20-30 phút).
- Sản phẩm PCR đƣợc trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol blue dạng vết) và nạp lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110 V trong khoảng 30 phút.
- Bản gel sau điện di đƣợc nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia tử ngoại (UV).
Điện di gel polyacrylamide
Điện di trên gel polyacrylamide. Gel polyacrylamide đƣợc trùnghợp ngay trƣớckhi dùng ở nhiệt độ phòng gồm 2 thành phần chính là acrylamide và bis- acrylamide. Quá trình trùng hợp nhờ xúc tác của Ammonim persulfate (APS) và TEMED. Khi trùng hợp từ hai thành phần chính trên sẽ hình thành một polymer dạng mạng lƣới. Tùy theo nồng độ của các chất thành phần mà gel tạo thành sẽ có hệ thống lỗ nhỏ, vừa hay lớn. Tƣơng tự, tùy hàm lƣợng của bis-acrylamide mà gel có mức độ liên kết chéo cao hay thấp.
Chuẩn bị bản gel polyacylamide 10% dùng để điện di kiểm tra sản phẩm PCR đƣợc cắt bằng enzym BccI (Bảng 2.8).
Bảng 2.8. Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thƣớc 7cm Thành phần Thể tích Monoacrylamide 30% 1,65 ml TBE 1X 3,3 ml APS 10% 37,5 l TEMED 3 l
Quy trình chuẩn bị gel polyacrylamide và điện di sản phẩm cắt enzym.
- Sau khi đổ gel xong, giữ nguyên bản gel để acrylamide polymer hóa trong khoảng 30 phút ở nhiệt độ phịng.
- Sau khi polymer hóa hồn tồn, rút lƣợc cẩn thận, gắn khuôn gel vào buồng điện di và làm đầy buồng điện di bằng đệm 1X TBE.
- Trộn các mẫu ADN với một lƣợng thích hợp của đệm 6X gel-loading dye. - Tra mẫu vào trong giếng bằng micropipette
- Nối nguồn điện di với bộ nguồn, chạy gel cho đến khi chỉ thị màu dịch chuyển đến vị trí mong muốn (30-35 phút). Tắt nguồn, lấy khuôn gel ra và đặt lên bàn.Tháo tấm kính nhỏ ở mặt trƣớc ra, tấm kính lớn ở phía sau đƣợc dùng làm giá đỡ và chuẩn bị nhuộm gel.
- Bản gel ngâm nhẹ trong dung dịch nhuộm EtBr trong 15-20 phút và quan sát dƣới tia tử ngoại (UV).