Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.4. Phân tích PCR-RFLP
Dựa trên kết quả giải trình tự đoạn gen MT-CO1, chúng tơi đã xác định đƣợc các vị trí biến đổi trên gen. Tìm hiểu vai trị của các biến đổi đó và lựa chọn những biến đổi có ý nghĩa nhất. Hai biến đổi đƣợc lựa chọn trong số các biến đổi xác định đƣợc trên gen MT-CO1 là biến đổi 6340T>C và 6253C>T để phân tích PCR-RFLP. Kích thƣớc sản phẩm cắt của các enzyme giới hạn đƣợc tính tốn phù hợp cho việc phát hiện các đột biến qua phổ băng điện di. Bảng 2.5 trình bày kích thƣớc sản phẩm cắt với enzyme giới hạn BccI và TaaI lần lƣợt để nhận biết các biến đổi
Bảng 2.5. Trình tự nhận biết của cacs enzyme cắt giới hạn
Tên
enzyme Vị trí nhận biết
Kích thƣớc sản phẩm cắt Khơng có biến
đổi Có biến đổi
BccI 5’...CCATC(N)4 ▼...3’ 3’...GGTAG(N)5▲...5’ 33bp, 128bp 161bp TaaI 5’...ACN▼GT...3’ 3’...TG▲NCA...5’ 30bp, 34bp, 97bp 64bp, 97bp Sau khi đƣợc nhân lên với cặp mồi 6221F-6381R, sản phẩm PCR đƣợc tiến hành phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn BccI và TaaI theo đúng hƣớng dẫn của nhà
sản xuất.
Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn đƣợc mô tả trong Bảng 2.6.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt với enzyne BccI, TaaI Thành phần Enzyme BccI(µl) Enzyme TaaI(µl) Thành phần Enzyme BccI(µl) Enzyme TaaI(µl)
10X buffer 1,5 0,67
Enzyme 0,25 0,33
Sản phẩm PCR 5 3,33
H20 8,25 5,67
Phản ứng cắt bởi enzyme BccI đƣợc tiến hành theo các bƣớc sau:
Bƣớc 1: Trộn các thành phần phản ứng với nhau theo đúng tỷ lệ trong Bảng 2.6
Bƣớc 2: Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 16 tiếng để phản ứng cắt diễn ra.
Bƣớc 3: Ủ hỗn hợp ở 65oC trong 20 phút để bất hoạt enzyme.
Các bƣớc tiến hành phản ứng cắt bởi enzyme TaaI thực hiện tƣơng tự đến bƣớc 2,