Chƣơng 1 TỔNG QUAN
1.3. Phức hệ cytochrom ec oxidase và genMT-CO1
1.3.4. Các phƣơng pháp phát hiện biến đổimtDNA
Phương pháp PCR-RFLP
Phƣơng pháp cơ bản và đƣợc sử dụng phổ biến nhất để xác định đột biến điểm của mtDNA: PCR-RFLP. Đây là sự kết hợp kỹ thuật PCR với kỹ thuật xác định đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn(RFLP). Đầu tiên, đoạn mtDNA có chứa đột biến đƣợc nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đó
đƣợc cắt bởi enzyme giới hạn thích hợp. Cuối cùng, các đột biến sẽ đƣợc nhận biết qua phổ băng điện di. Phƣơng pháp PCR-RFLP giúp phát hiện các đột biến và khơng địi hỏi trang thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên, chúng có nhƣợc nhiểm độ nhạy thấp và kém chính xác[22].
Phương pháp Real-time PCR
Realtime PCR sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng lƣợng ADN đƣợc nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu huỳnh quang. PCR định lƣợng cho phép xác định số bản sao ADN ty thể ban đầu có trong mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Có hai loại phƣơng pháp phân tích hay đƣợc sử dụng: Phƣơng pháp sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN: Chất nhuộm này có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi ADN, làm cho sợi đôi ADN phát đƣợc ánh sáng huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích[45].
Phƣơng pháp PCR/ASO (An allele-specific oligonucleotide): Phƣơng pháp sử dụng đầu dị oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh quang hoặc phóng xạ. Với sựcó mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng và có sự bắt cặp của đầu dị lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, khi đó sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng nếu nó nhận đƣợc nguồn sáng kích thích, hay là tín hiệu nhận biết đồng vị phóng xạ. Phƣơng pháp realtime PCR có độ nhạy cao, cho phép định lƣợng đột biến[45].
Phương pháp định lượng DHPLC
Phƣơng pháp DHPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nƣớc trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN dị sợi kép (heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex) tại nhiệt độ tối ƣu. Các mạch ADN đƣợc phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đơi khơng chính xác. Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thƣờng. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phƣơng pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ty thể, hoặc một vùng nhất định của ADN ty thể để xác định đột biến[36].
Phương pháp ImageJ
ImageJ là phần mềm xử lý ảnh, ImageJ có thể hiển thị, chỉnh sửa, phân tích, xử lý, lƣu lại và in ảnh theo 8-bit, 16-bit và 32-bit. Bên cạnh đó, phần mềm này cịn có thể đọc bất kì định dạng ảnh nào, bao gồm TIFF, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS... Nó cũng có thể xác định khu vực và thông số giá trị pixel của một lựa chọn nào đó do ngƣời dùng xác nhận; tính tốn diện tích, độ sáng tối để tạo biểu đồ mật độ điểm ảnh. Trong lĩnh vực sinh học, ImageJ thƣờng đƣợc sử dụng để phân tích các băng protein hay các băng ADN.