β
Lấy vi khuẩn đã phát triển trên môi trường TSI hoặc từ mơi trường khơng chọn lọc khác có chứa 1,0% lactoza vào ống nghiệm có chứa 0,25 ml nước muối sinh lý, hoà tan. Thêm 1 giọt toluen vào ống rồi lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG, ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37oC. Kiểm tra ống định kỳ trong 24
giờ. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi dung dịch có màu vàng.
Có thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG. Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý. Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống rồi ủ ấm và đọc kết quả như trên.
Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat. Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl. Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt
độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi
Vibriostat tạo một vịng vơ khuẩn xung quanh các đĩa O/129.
Hình 3.12: Kết quả thử nghiệm ONPG
+ Tính ưa mặn (NaCl): cấy chuyển từ TSA vào môi trường canh
trypton (khơng có NaCl), canh trypton (3% NaCl), canh trypyon (6% NaCl) và canh trypton(8% NaCl), canh trypton (10% NaCl). Ủ qua đêm ở 37oC. Kết quả tính ưa mặn của V.cholerae , V.parahaemolyticus như sau:
Tính ưa mặn
V.cholerae V.parahaemolyticus V.culnificus
0% + - -
3% + + +
6% - + +
8% - + -
10% - - -
+ Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn
O/129Vibriostat
Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl. Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt
độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi
Vibriostat tạo một vịng vơ khuẩn xung quanh các đĩa O/129.
+ Thử nghiệm kháng huyết thanh.
Mục đích: xác định các dịng Vibrio khác nhau.
Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vơ trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và khơng có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá
Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae theo Bảng 3.2 và Bảng 3.3
Bảng 3.2. Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1
Kháng nguyên Kháng huyết
thanh đa giá O1
Dung dịch muối sinh lý
Kết luận
Chủng có kết quả sinh hố tương tự V. cholerae
+ - V.cholerae O1
Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae
- - V.cholerae non- O1
Chủng có kết quả sinh hố tương tự V. cholerae
+ + Chủng không đặc hiệu
với kháng nguyên O nhóm 1
Bảng 3.3. Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.choleraeO1
Kháng nguyên Kháng huyết thanh Inaba Kháng huyết thanh Ogawa Dung dịch muối sinh lý Kết luận V. cholerae O1 + - - Chủng Inaba V. cholerae O1 - + - Chủng Ogawa V. cholerae O1 + + - Chủng Hikojima
3.1.1.6. Đọc kết quả
Phát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g (10g) mẫu.
3.2. Phương pháp hiện đại
3.2.1. Phương pháp miễn dịch học – Elisa (Enzyme Linked mmunosorbent Assays) mmunosorbent Assays)
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Kỹ thuật ELISA có thể được sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng do V.harveyi trên tơm, mẫu nước và có thể xác định tất cả các dòng Vibrio spp. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể và gồm các bước cơ bản sau:
-
Kháng nguyên chưa biết được gắn trên một bề mặt.
-
Kháng thể biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết
với enzyme.
-
Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín
hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng
nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết
định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay
khơng có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu.
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng
nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate).
Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt
của đĩa.
Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với
một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra.
Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên –
quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần
kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này.
Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ
chất) sẽ sảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA
nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và
độ chính xác của ELISA. Có những phương pháp ELISA như sau:
3.2.1.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA)
Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng (được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên
này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong
các mẫu chưa biết.
Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng
nguyên chuẩn.
Thêm dung dịch protein không tương tác (non – interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blocking" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp
Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng nguyên còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng
để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme).
Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.
Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh
quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
Hình 3.13: ELISA gián tiếp.
3.2.1.2. Sandwich ELISA
Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp):
-
Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể.
-
Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt.
-
Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định.
-
Rửa đĩa, kháng kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi.
-
-
Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu
cho kháng thể sơ cấp).
-
Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi.
-
Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa
điện.
Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng kháng thể.
Hình 3.14: Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng kháng thể (2) Thêm mẫu cần xác định kháng nguyên. Kháng nguyên (nếu có) sẽ gắn với kháng thể; (3) mẫu cần xác định kháng nguyên. Kháng nguyên (nếu có) sẽ gắn với kháng thể; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với Kháng nguyên; (4) Thêm kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme. Kháng thể thứ cấp sẽ gắn với kháng thể dùng
để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có
thể phát hiện và đo được.
3.2.1.3. ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA)
Các giếng trong kỹ thuật ELISA được gắn một kháng thể sơ cấp chống lại kháng nguyên. Các tác nhân phát hiện là một phức hợp đồng hóa trị của kháng nguyên này và một enzyme thường sử dụng là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase.
Các tác nhân này được trộn chung với mẫu dịch chiết của kháng nguyên và phức hợp này được cho vào trong giếng. Trong giếng đối chứng (không chứa kháng
sơ cấp và sau đó thêm các cơ chất tạo màu, kết quả là hiện màu trong mẫu. Trong các giếng kiểm tra, các phân tử kháng nguyên tự do trong dịch chiết cạnh tranh với các phức hợp gắn trên các kháng thể sơ cấp. Nồng độ kháng nguyên càng cao, phức hợp gắn trên kháng thể sơ cấp càng tí dẫn đến màu trong giếng càng nhạt. Thí
nghiệm này nhanh, dễ dàng thực hiện.
Hình 3.15: ELISA cạnh tranh.
3.2.2. Kỹ thuật PCR chuẩn (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên
hoạt động của các dNTP tự do là enzyme polymerase, sau 20-35 chu kì có thể nhân
được số bả sao rất lớn của đoạn DNA cần khuếch đại. Kỹ thuật PCR chuẩn chỉ thực
hiện được khi biết rõ các trình đặc hiệu ở 2 đầu DNA cần nhân gen (đoạn khn) để có thể thiết kế các cặp mồi đặc hiệu .
Hiện nay có thể sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đoán nhanh bệnh
3.2.2.1 Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp này là phát hiện một đoạn DNA đặc hiệu cho
Vibrio spp.
Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khn.
Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để
hình thành một mạch mới hồn chỉnh. Trong một phản ứng PCR để khuyếch đại
một trình tự đặc biệt nào đó, ta cần phải có những thơng tin tối thiểu về trình tự đó
để thiết kế các mồi bổ sung ở hai đầu mạch bao gồm một mồi xuôi (sense primer)
và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene. Một khi được cung cấp hai mồi bổ sung ở hai đầu, phản ứng sẽ cho ra hàng loạt bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó.
3.2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:
-
Giai đoạn biến tính: trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần
cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao trong vòng 30 giây – 1phút, thường là ở 940C.
-
Giai đoạn bắt cặp: ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi
bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng từ 30° – 70°C khoảng 40 giây – 1 phút.
-
Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 720C cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc
độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thưòng kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút.
Trong phản ứng PCR, chu kỳ ba giai đoạn sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng bản sao lên gấp đôi. Sự khuếch đại của phản ứng là theo cấp số nhân và theo tính tốn, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu
Hình 3.16: Các giai đoạn trong phản ứng PCR.
Phát hiện gen cholerae toxin bằng phương pháp PCR: Gen cholera toxin hiện diện trong V.cholerae nhưng nó khơng biểu hiện trong điều kiện thí nghiệm bình thường. Vì vậy, kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại gen tcx được thực hiện để phát hiện V.cholerae. Phương pháp này cung cấp kết quả nhanh và chính xác hơn.
• Các bước thực hiện :
-
Lấy 1ml mẫu môi trường APW vào ống ly tâm 1.5ml và đun sôi trong 10 phút. Lysate có thể sử dụng ngay lập tức cho PCR hoặc được lưu trữ ở -20oC cho
đến khi sử dụng.
-
Mẫu DNA sau khi thu nhận được pha lỗng theo nồng độ thích hợp.
-
-
Pha lỗng mẫu DNA .
- Thực hiện phản ứng PCR 50 ml .Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần sau : • 10X Tap buffer 5.0 ml • MgCl2 ( 25Mm ) 1.5 ml • Tris- HCl 10 ml • DATP , Dttp, Dgtp , dctp 4x0.2ml • Primer :
• Primer xuôi : 5’-TGA AAT AAA GCA GTC AGG TG-3’ 0.5ml
• Primer ngược : 5’-GGT ATT CTG CAC AAT CAG-3’ 0.5ml
• Nước cất khử ion 31.5 ml • Tap polymerase ( 2,5 U) 0.2ml Thiết lập phản ứng PCR Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC ) Giai đoạn 1 3 94 Giai đoạn 2 Biến tính 1 94 Primer 1 55 Primer mở rộng 1 72 Giai đoạn 3 3 72 Số chu kỳ :20Ỉ 35
Sơ đồ phản ứng PCR:
3.2.3. Kỹ thuật PCR phức ( Multiplex PCR )
Kỹ thuật PCR phức là phương pháp PCR sử dụng đồng thời cùng 1 lúc nhiều
cặp mồi đặc hiệu khác nhau, để nhận các đoạn DNA đặc trưng khác nhau trên một phân tử DNA, hoặc trên các phân tử DNA khác nhau. Kỹ thuật PCR phức thường sử dụng để nhân các exon của gen độc tố của Vibrio spp.
Kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện sớm tôm, cá bị nhiễm bệnh do các
loài virus, vi khuẩn khác nhau. Các bước thực hiện tương tự như kỹ thuật PCR chuẩn, u cầu tính tốn tỉ lệ cặp mồi và lượng DNTP, enzyme DNA polymerase thích hợp để hiệu quả PCR chính xác .
Các bước thực hiện : tương tự như PCR chuẩn .
- Thực hiện multiplex PCR gồm 10 gen của DNA tinh khiết .Hỗn hợp phản ứng gồm :
• Triphosphates deoxynucleoside.
• DNA polymerase Amplitaq (3U).
• Nước cất khử ion.
• Bộ đệm PCR [60ml Tris-Cl (pH 9.0), 15ml(NH4)2 SO4, 2ml MgCl2]
hay đệm C [50ml Tris-Cl (pH 8.9), 50ml KCl, 2.5 ml MgCl2] Các Oligonucleotide primer của đối tượng gene sử dụng là :
• V.vulnificus : vvh và viuB
• V.parahaemolyticus : tlh, tdh, trh, ORF8.
• V.cholera : ompU, toxR, tcpl
Multiplex PCR
3.2.4. Kỹ thuật DNA microarray
Kỹ thuật DNA microarray là kỹ thuật lai các đoạn cDNA mạch đơn ngắn được
đánh dấu huỳnh quang , với tập hợp các đoạn oligonucleotid đã biết trình tự được
gắn ở các vị trí được xác định trên GeneChip để kiểm tra và phát hiện 1 trình tự
nucleotide (1 gene) nào đó .
Kỹ thuật DNA microray dựa trên cơ sở các đoạn DNA mạch đơn cần nghiên cứu có thể bắt cặp với các mẫu dị có trình tự tương đồng nhau theo nguyên lý Chargaff (A liên kết với T, G liên kết với C) tạo nên các phân tử lai. Dựa vào kỹ thuật phát
Thiết lập phản ứng PCR phức
Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC )
Giai đoạn 1 3 94 Giai đoạn 2 Biến tính 1 94 Primer + V.parahaemolyticus 1 55 + V.vulnificus 1 65 +V. cholera 1 60 Primer mở rộng 1 72 Giai đoạn 3 3 72 Số chu kỳ :20Ỉ 35
hiện huỳnh quang, với các máy quét scanner chuyên dụng có thể xác định được vị