Phát hiện gen cholerae toxin bằng phương pháp PCR: Gen cholera toxin hiện diện trong V.cholerae nhưng nó khơng biểu hiện trong điều kiện thí nghiệm bình thường. Vì vậy, kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại gen tcx được thực hiện để phát hiện V.cholerae. Phương pháp này cung cấp kết quả nhanh và chính xác hơn.
• Các bước thực hiện :
-
Lấy 1ml mẫu môi trường APW vào ống ly tâm 1.5ml và đun sôi trong 10 phút. Lysate có thể sử dụng ngay lập tức cho PCR hoặc được lưu trữ ở -20oC cho
đến khi sử dụng.
-
Mẫu DNA sau khi thu nhận được pha lỗng theo nồng độ thích hợp.
-
-
Pha lỗng mẫu DNA .
- Thực hiện phản ứng PCR 50 ml .Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần sau : • 10X Tap buffer 5.0 ml • MgCl2 ( 25Mm ) 1.5 ml • Tris- HCl 10 ml • DATP , Dttp, Dgtp , dctp 4x0.2ml • Primer :
• Primer xuôi : 5’-TGA AAT AAA GCA GTC AGG TG-3’ 0.5ml
• Primer ngược : 5’-GGT ATT CTG CAC AAT CAG-3’ 0.5ml
• Nước cất khử ion 31.5 ml • Tap polymerase ( 2,5 U) 0.2ml Thiết lập phản ứng PCR Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC ) Giai đoạn 1 3 94 Giai đoạn 2 Biến tính 1 94 Primer 1 55 Primer mở rộng 1 72 Giai đoạn 3 3 72 Số chu kỳ :20Ỉ 35
Sơ đồ phản ứng PCR:
3.2.3. Kỹ thuật PCR phức ( Multiplex PCR )
Kỹ thuật PCR phức là phương pháp PCR sử dụng đồng thời cùng 1 lúc nhiều
cặp mồi đặc hiệu khác nhau, để nhận các đoạn DNA đặc trưng khác nhau trên một phân tử DNA, hoặc trên các phân tử DNA khác nhau. Kỹ thuật PCR phức thường sử dụng để nhân các exon của gen độc tố của Vibrio spp.
Kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện sớm tôm, cá bị nhiễm bệnh do các
loài virus, vi khuẩn khác nhau. Các bước thực hiện tương tự như kỹ thuật PCR chuẩn, u cầu tính tốn tỉ lệ cặp mồi và lượng DNTP, enzyme DNA polymerase thích hợp để hiệu quả PCR chính xác .
Các bước thực hiện : tương tự như PCR chuẩn .
- Thực hiện multiplex PCR gồm 10 gen của DNA tinh khiết .Hỗn hợp phản ứng gồm :
• Triphosphates deoxynucleoside.
• DNA polymerase Amplitaq (3U).
• Nước cất khử ion.
• Bộ đệm PCR [60ml Tris-Cl (pH 9.0), 15ml(NH4)2 SO4, 2ml MgCl2]
hay đệm C [50ml Tris-Cl (pH 8.9), 50ml KCl, 2.5 ml MgCl2] Các Oligonucleotide primer của đối tượng gene sử dụng là :
• V.vulnificus : vvh và viuB
• V.parahaemolyticus : tlh, tdh, trh, ORF8.
• V.cholera : ompU, toxR, tcpl
Multiplex PCR
3.2.4. Kỹ thuật DNA microarray
Kỹ thuật DNA microarray là kỹ thuật lai các đoạn cDNA mạch đơn ngắn được
đánh dấu huỳnh quang , với tập hợp các đoạn oligonucleotid đã biết trình tự được
gắn ở các vị trí được xác định trên GeneChip để kiểm tra và phát hiện 1 trình tự
nucleotide (1 gene) nào đó .
Kỹ thuật DNA microray dựa trên cơ sở các đoạn DNA mạch đơn cần nghiên cứu có thể bắt cặp với các mẫu dị có trình tự tương đồng nhau theo nguyên lý Chargaff (A liên kết với T, G liên kết với C) tạo nên các phân tử lai. Dựa vào kỹ thuật phát
Thiết lập phản ứng PCR phức
Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC )
Giai đoạn 1 3 94 Giai đoạn 2 Biến tính 1 94 Primer + V.parahaemolyticus 1 55 + V.vulnificus 1 65 +V. cholera 1 60 Primer mở rộng 1 72 Giai đoạn 3 3 72 Số chu kỳ :20Ỉ 35
hiện huỳnh quang, với các máy quét scanner chuyên dụng có thể xác định được vị trí của các phân tử lai.
3.2.4.1. Vật liệu và phương pháp
Các chủng được sử dụng trong phương pháp này là : V.cholerae 154 serovar 0:1 Inaba Tox (ATCC 14100), V.vulnificus M06-24 (0), V.prahaemolyticus F113 –A, và V.parahaemolyticus nhóm huyết thanh (serotype) 03:K6 BCA 98-03372.
Sử dụng môi trường MCPC agar (Modified cellobiose – polymyxin-colistin) và TCBS agar (thiosulfate-citrate – bile-sucrose) dùng để thu nhận khuẩn lạc của 3 lồi
Vibrio.
• V.cholera được nuôi trên môi trường Luria-Bertani agar ở 37oC.
• V. vulnificus được ni trên mơi trường marine agar ở 37oC.
• V.parahaemolyticus được ni trên mơi trường nutrient agar có bổ sung 3
% NaCl ở 37oC.
Gene AND xác định: gene AND được lấy từ 1ml khuẩn lạc đem ly tâm 9000xg, sau đó loại bỏ các tế bào bằng 550ml dung dịch TE (10mM Tris-Cl, 1mM EDTA [pH8]). Sau 1 giờ ủ, thêm vào 100ml NaCl 5M cùng với 80 ml
cetyltrimethylammonium bromide (ACTAB)–NaCl để tạo phức với polysaccharides.
Các mẫu dò của các đối tượng gene sử dụng là :
• V.vulnificus : vvh và viuB
• V.parahaemolyticus : tlh, tdh, trh, ORF8
• V.cholerae : ompU, toxR, tcpl
• Vibrio cổ điển : hlyA
Hỗn hợp PCR phức sau khi hợp thành biotin – CTP, phản ứng kết thúc khi cho 5ml dung dịch 0.2M EDTA và phản ứng hỗn hợp làm biến tính ở 95oC trong 5 phút.
Chuẩn bị DNA array: pha lỗng đầu dị oligonucleotide trong đệm Spotting (0.1 M NaH2PO4, 0.2 NaCl, SDS 0.01 %). Mười hai DNA array độc tạo đốm giống 4
sao chép trên mỗi mảng. Mỗi mảng gồm 1 oligonucleotide chuyên biệt ( khoảng 25 mer ) liên kết với biotin.
3.2.4.2. Các bước thực hiện
• Thu thập các mẫu, phá vỡ màng tế bào và tách RNA thơng tin .
• Phiên mã ngược: thực hiện mã ngược với các mồi oligo, enzyme phiên mã
ngược và dNTP các loài tạo nên các phân tử cDNA tương ứng với các mRNA.
• Phiên mã in-vitro tạo các mạch RNA đánh dấu huỳnh quang: sử dụng T7 RNA
polymerase, biotin – CTP, từ mỗi mạch đơn cDNA tạo nên khoảng 50 - 100 cRNA – Biotin.
• Cắt đoạn: đun cRNA – Biotin ở 98oC trong 3 phút trong dung dịch đệm
hybridization (4x SSC [1x SSC gồm 15mM NaCl cộng với 0.15 mM sodium citrate] [pH 7.0 ], 5x Denhardt’s soludition [0.1% Ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1 % bovine serum albumin]), cắt thành các đoạn cRNA – biotin khoảng 35-200 ribonucleotide.
• Lai: các đoạn cRNA – biotin được chuyển lên các Genechip chứa các mẫu dị
cDNA mạch đơn đã biết trình tự thực hiện phản ứng lai.
• Nhuộm: rửa genechip để loại bỏ các cRNA đánh dấu huỳnh quang không
được lai, sau đó nhuộm các phân tử lai bằng strepavidin-phycoerythrin.
• Phân tích: các GeneChip đã nhuộm được đưa vào các thiết bị scanner chuyên
dụng quét dự liệu phân tích kết quả .
3.2.5. Kỹ thuật RAPD
RAPD là kỹ thuật phát hiện tính đa dạng của ADN nhân bản ngẫu nhiên dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR. Khác với PCR thơng thường cần phải biết thơng tin về trình tự ADN của đoạn gen cần nhân bản để thiết kế đoạn mồi, kỹ thuật RAPD chỉ cần một lượng nhỏ ADN có nguồn gốc genom là đủ. Các đoạn mồi được tổng hợp dưới dạng decamer, tức là các oligonucleotit chỉ dài 10 nucleotit theo những trình tự nhất định. Đoạn mồi được bắt cặp với ADN khuôn ở nhiệt độ khơng cao (khoảng 36oC) cho nên sẽ có nhiều đoạn ADN khác nhau được nhân bản.
Chu trình nhiệt để phát hiện tính đa hình ADN nhân bản ngẫu nhiên: 95oC – 5 phút, 95oC – 1 phút, 36oC – 1 phút, 72oC – 2 phút, 45 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4), 720C – 8 phút, kết thúc ở 4oC.
Mồi được sử dụng cho phản ứng RAPD ký hiệu là RAPD1 có trình tự như sau: RAPD1: 5’- GGTGCGGGAA-3’ (Mồi RAPD1 đã được sàng lọc trong tổng số 6
mồi vì nó cho kết quả đa hình gen cao nhất)
Thành phần tham gia phản ứng RAPD gồm: Nước khử ion vô trùng (18,2 μl),
Đệm cho Tag-polymerase (2,5μl), dNTP (2 μl), Mồi RAPD (1μl), Tag-polymerase
(0,3 μl), ADN khuôn (ADN tổng số của mỗi chủng V. cholerae – 1 μl). Tổng thể
tích cho một phản ứng là 25 μl.
Điện di ADN trên gel agaroza
Các đoạn ADN có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong một điện trường có điện thế và
cường độ thích hợp. Hố chất điện di: agaroza 1-1,5% (phụ thuộc vào kích thước
phân tử ADN); dung dịch đệm TAE 50X (60,5g Tris base; 14,3ml axit axetic; 25ml EDTA 0,5M, pH 8.0), 10mg/ml bromit ethidium (ethidium bromide -EtBr), đệm tra mẫu 10X (Loading buffer: 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3% glyxerol 100% và dẫn bằng nước đến 1 ml). Quy trình điện di như sau:
• Chuẩn bị gel agaroza: Cho 1g agaroza (đối với điện di ADN tổng số và sản
phẩm PCR) hoặc 1,5g (đối với điện di sản phẩm RAPD) vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun cho agaroza tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50-600C, đổ
dung dịch agaroza vào khay gel điện di có cài sẵn răng lược. Sau 30-60 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel từ 1-2mm.
• Mẫu ADN được trộn với đệm tra mẫu theo tỉ lệ 5:1 có tác dụng tạo mầu và để
mẫu lắng xuống dưới, tra mẫu vào các giếng nhỏ trên gel, chạy điện di ở điện thế ổn
định 100V cùng chỉ thị ADN chuẩn để xác định trọng lượng phân tử, quan sát sự di
• Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khn, ngâm khoảng 10 phút trong dung dịch
TAE 1X có EtBr (2mg/ml) trên một máy lắc nhẹ, sau đó rửa bằng nước, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254nm trên máy soi ADN và chụp ảnh.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Qua q trình làm bài khóa luận này chúng tơi nhận ra rằng Vibrio spp là 1 loài vi khuẩn nguy hiểm cho cả con người và động vật, nhóm vi khuẩn này có thể lây nhiễm trên tất cả các giai đoạn phát triển của động vật thủy sản, trên tất cả các giai đoạn chế biến thực phẩm thủy hải sản và đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành
thủy hải sản trên thế giới và tại Việt Nam, ảnh hưởng đến nền kinh tế quốc dân. Vi khuẩn này rất nguy hiểm đặc biệt là các độc tố đường ruột của nó. Nó gây ra các vụ nhiễm khuẩn đường ruột còn được coi là 1 siêu kháng nguyên rất nguy hiểm và là sự bắt đầu của các triệu chứng sốc độc hại.
Tóm lại, trên thế giới hiện nay có rất nhiều loại vi khuẩn nguy hiểm khơng chỉ là
Vibrio spp mà cịn là S.aureus, Clostridium botulinum, E.coli, Salmonella. Đây đều
là những vi khuẩn nguy hiểm đến sức khỏe của con người. Việc tìm hiểu và nghiên cứu về chúng là rất cần thiết để đề ra các biện pháp phòng ngừa thích hợp nhưng có lẽ ý thức của mỗi con người là biện pháp phịng ngừa hiệu quả nhất.
Có những phương pháp thông dụng để xác định vi khuẩn Vibrio spp. như là
phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc trưng, phương pháp ELISA dựa theo
nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể, phương pháp PCR dựa vào việc phát hiện đoạn DNA đặc hiệu của vi khuẩn Vibrio sp. và có thể đưa đến những biện pháp phịng ngừa, điều trị thích hợp.
4.2. Kiến nghị
Trên cơ sở được biết những mối nguy hại của Vibrio spp gây ra trên hải sản,
chúng tôi mong rằng các nhà chức trách cần tiến hành những biện pháp kiểm tra nghiêm khắc đối với những người làm ăn lấy lợi ích kinh tế đặt lên hàng đầu sử
dụng những thực phẩm không tươi ngon, không đảm bảo chất lượng trong kinh doanh hải sản cho người tiêu dùng, nhà chức trách nên thường xuyên kiểm tra các cơ sở kinh doanh, các mặt hàng hải sản để tiến hành ngăn chặn kịp thời những hành vi không đúng qui định.
Cần mở rộng nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn Vibrio spp khác nhau để tổng
hợp, đưa ra các phương pháp xác định chính xác và biện pháp phịng ngừa thích hợp cho bệnh ở động vật thủy sản.
Nghiên cứu phát triển và ứng dụng chế phẩm vi sinh vào trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao chất luợng sản phẩm thủy sản, bảo đảm an toàn thực phẩm, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao và khắt khe của xã hội.
Quá trình kiểm tra chất lượng cần tiến hành thường xuyên ở tất cả các công
đoạn sản xuất cuối cùng, kể cả giai đoạn phân phối và bảo quản. Các giai đoạn của
thủ tục kiểm tra bao gồm :
- Nhận diện các chuẩn mực về chất lượng .
- Thiết lập các tiêu chuẩn chất lượng cho mỗi một chuẩn mực . - So sánh các kết quả với tiêu chuẩn .
- Đánh giá và phân tích các sai biệt quan sát thấy. - Đề ra các biện pháp sữa chữa .
Bên cạnh đó, chúng tơi mong rằng người tiêu dùng hãy thật cảnh giác trước khi lựa chọn các loại thực phẩm nói chung và hải sản nói riêng. Các nhà khoa học cũng cần có thêm nhiều nghiên cứu hơn nữa và thong tin rộng rãi trên các phương tiện thông tin đại chúng để người dân có những kiến thức cơ bản nhằm giảm thiếu những vụ ngộ độc thực phẩm .
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu trong nước
1. Bùi Quang Tề, (1996). Bệnh tơm cá và giải pháp phịng trị.Tạp chí thuỷ sản số 4/1996.
2. Đỗ thị Hịa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Huy Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004).
Bệnh học thủy sản. NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
3. Trần Linh Thước, (2007). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo dục.
4. PGS.TS Nguyễn Phùng Tiến, GS.TS Bùi Minh Đức, GS.TS Nguyễn Văn Dịp _ Vi sinh vật trong thực phẩm – kỹ thuật kiễm tra và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm.
Tài liệu tiếng Anh
1. Tom Defoirdt, Peter Bossier, Patrick Sorgeloos and Willy Verstraete, (2004). The impact of mutations in the quorum sensing systems of Aeromonas
hydrophila, Vibrio anguillarum and Vibrio harveyi on their virulence towards
gnotobiotically cultured Artemia franciscana. Ghent University, Belgium.
Tài liệu web
1. http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Sinh_h%E1%BB%8Dc_ph%C3%A2n _t%E1%BB%AD 2. http://www.mekongfish.net.vn/modules/news/article.php?storyid=68 3. http://www.ctu.edu.vn/colleges/aquaculture/thuysanweb/modules/news/article. php?storyid=236 4. http://www.vietlinh.com.vn/kithuat/ca/fishdisease.htm 5. http://kiemnghiemthucpham.blogspot.com/2011/01/28-tcn2002004-vibrio- cholerae-trong-san.html
6. http://www.vccimekong.com.vn/VCCICT/folderupload/Bai%20trinh%20bay %20cua%20ong%20To%20Viet%20Chau%20- %20Bo%20Nong%20Nghiep%20va%20PTNT.pdf 7. http://www.fishviet.net/fishviet/index.php?page=news&content=11&article=3 3 8. http://www.impeqn.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=110 1&ID=3669 9. http://duocphamvn.com/baiviet/6161-28-TCN200-2004-Vibrio-cholerae- trong-san-pham-thuy-san-Phuong-phap-dinh-tinh.thuoc 10. http://diephv.wordpress.com/2011/05/28/kh%E1%BA%A3o-sat- s%E1%BB%B1-da-hinh-gen-c%E1%BB%A7a-cac-ch%E1%BB%A7ng- vibrio-cholerae-b%E1%BA%B1ng-k%E1%BB%B9-thu%E1%BA%ADt-rapd/ 11. http://www.tut.edu.vn/images/stories/tapchikhoahocungdung/tckhud13/44- 45.pdf 12. Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC53186/ 13. Http://www.fda.gov/Food/SciencePresearch/LaboratoryMethyods/Bacteriologi cal-AnalyticalManualBAM/UCM070830 14. Http://www.people.uwec.edu 15. Http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongphapthucnghiem- dinhtenvk02.htm. 16. Http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/ 17. Http://www.genome.gov/10000533.
PHỤ LỤC
Một số mơi trường chính trong phương pháp truyền thống nuôi cấy và phân lập Vibrio spp
Canh thang bromcresol
• Pepton : 10,00 g
• Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Cao thịt bị : 3,00 g
• Tím bromcresol : 0,04 g
• Nước cất : 1,00 lít pH = 7,0 0,2 (ở nhiệt độ 250C)
• Hồ tan các thành phần trên, chỉnh pH sao cho môi trường sau khi pha đạt yêu
cầu như trên rồi rót 2,5 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút.
Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton và D-mannoza) trong nước cất rồi lọc vô trùng. Thêm 0,278 0,002 ml dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trường cơ bản. Mơi trường cuối cùng có nồng độ carbohydrat là 5%.
Canh thang muối trypton: có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 %
NaCl (ký hiệu lần lượt là: T1N0; T1N1; T1N3; T1N6; T1N8 và T1N10) Hồ tan 10 g trypton trong 1 lít nước cất. Sau đó, thêm lần lượt : 10, 30, 60, 80 và 100 g NaCl để được các canh thang trypton có giải nồng độ NaCl như trên. Sau đó, khuấy đều, rồi chỉnh pH sao cho mơi trường sau khi hấp có pH = 7,2 (ở nhiệt độ 250C). Tiến hành rót 5 ml mơi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ
1210C trong 15 phút.
Chú thích: các ống mơi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi nồng độ muối.
Canh thang urê
• urê : 20,00 g
• Cao nấm men : 0,10 g
• Ðỏ phenol : 0,01 g
• Nước cất : 1,00 lít pH = 6,8 0,1 (ở nhiệt độ 250C)
• Hồ tan các thành phần. Khơng được hấp khử trùng, lọc vơ trùng bằng màng lọc có đường kính lỗ là 0,45 ml. Sau đó, rót khoảng 1,5 - 3,0 ml vào các ống nghiệm hoặc đĩa petri đã được sấy vô trùng.