Dùng que cấy vòng lấy mẫu, cấy ria lên mặt đĩa môi trường thạch TCBS để
phân lập khuẩn lạc đơn. Ủ trong 18 – 22 giờ.
Khuẩn lạc đặc trưng của Vibrio có hình dạng: KL V.cholerae và V.
alginolyticus lớn, đường kính 2-3mm,láng, màu vàng, hơi phẳng, tâm đục, có quầng trắng đục xung quanh. Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V.
vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh dương. 25g mẫu + 225ml canh tăng sinh chọn lọc (APW) đồng nhất trong 30
giây độ pha loãng 10-1
Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang môi trường không chọn lọc T1N1 (3% NaCl) hoặc TSA bổ sung 3% NaCl. Đem ủ 37 oC trong 18- 24h.
Thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng huyết thanh.
Kết luận.
Phát hiện hay không phát hiện Vibrio trong 25g (10g) mẫu.
3.1.1.5. Thuyết minh quy trình
Ö Chuẩn bị mẫu
Cân chính xác 25g (10g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm 225ml (90ml) dung dịch pha loãng mẫu APW. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian dập mẫu là 30 giây. Tất cả các thao tác phải thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Ö Tăng sinh chọn lọc
Dùng nước peptone kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường hợp V.cholerae và V.
alginolyticus, V. vulnificus.
Dùng canh Colistine cho trường hợp V.parahaemolyticus. Sau đó đem ủở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
Ö Phân lập
Sau 24 giờ, dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối trên môi trường APW và cấy lên bề mặt đĩa môi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 37oC trong 18 – 22 giờ. Hình dạng khuẩn lạc đặc trưng của các loài Vibrio trên môi trường này như sau: khuẩn lạc V.cholerae và V. alginolyticus lớn, đường kính 2-3mm, láng, màu vàng, hơi phẳng, tâm đục, có quầng trắng đục xung quanh. Khuẩn lạc
V.parahaemolyticus và V. vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh dương.
Hình 3.2: Phân lập Vibrio trên môi trường MacConkey
Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp trên môi trường TCBS
Tiếp theo, cấy chuyền sinh khối từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập TCBS thạch sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl, ủ 37 oC trong 18- 24h để thu sinh khối sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa.
Ö Thử nghiệm sinh hóa
Thử nghiệm sinh hóa quan trọng để phát hiện hay phân biệt các loài Vibrio là: quan sát tính di dộng trên kính hiển vi, quan sát sự di động trên thạch mềm và các thử nghiệm khác.
Bảng 3.1. Các đặc điểm sinh hóa của Vibrio cholerea và Vibrio parahaemolyticus Thử nghiệm sinh hóa Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerea ONPG (-) (+) Lactose (-) (-) ADH (-) (-) LDC (+) (+) TDA (-) (-) Indol (+) (+) Manose (+) (+) Sucrose (-) (+) Oxidase (+) (+) NaCl 0% (-) (+) NaCl 3% (+) (+) NaCl 6% (+) (-) NaCl 8% (+) / (-) (-) NaCl 10% (-) (-)
+ Thử nghiệm trên môi trường TSI, KIA
Nhằm xác định vi sinh vật sử dụng các nguồn carbohydrate nào, có sinh ga hay không, có sinh H2S hay không.
Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống thạch nghiêng TSI hoặc KIA. Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ.
Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S. Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S.
Hình 3.4: Kết quả thử nghiệm TSI/ KIA
+ Thử nghiệm với các canh thang trypton muối
Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 %. Nuôi ủở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ, rồi
ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 3% và làm đục môi trường.
+ Thử nghiệm lên men - oxy hoá
Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson glucoza hoặc O/F glucoza. Phủ khoảng 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng vào một trong 2 ống, ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37oC trong 1 - 2 ngày.
V. cholerae lên men glucoza làm môi trường Hugh - Leifson từ màu tím chuyển thành vàng và môi trường O/F từ màu xanh thành vàng.
+ Thử nghiệm oxidaza
Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt thuốc thử oxidaza. Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc que gỗ vô trùng lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử
oxidaza. V. cholerae làm vết ria có màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây . Chú thích: không dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này.
+ Nhuộm gram
Kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn, với thành phần thuốc nhuộm gồm có tím gentian, dung dịch lugol, Fucsin kiềm bằng cách cố định tiêu bản sau đó nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên trong 2 phút, rửa nước, sau đó nhỏ dung dịch lugol lên trong 2 phút, hất đi, tẩy mầu bằng cồn 90o tới khi bạc màu, rửa nước, nhỏ dung dịch Fucsin kiềm ( pha loãng tỷ lệ 1/10 ) lên trong 1/2 phút, rửa nước, để tiêu bản khô trong không khí hoặc dùng giấy thấm, soi tiêu bản bằng vật kính dầu.
Nhận biết vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, có hình thể mảnh, cong, hình dấu phẩy, không có vỏ, không sinh nha bào, khi nuôi cấy lâu ngày sẽ có sự thay đổi về
hình thể so với ban đầu.
V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.
+ Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 420C
Cấy vi khuẩn từ TSA vào một ống canh thang trypton 1% NaCl. Ủ ở nhiệt độ
42oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 42oC làm môi trường bịđục.
+ Thử nghiệm lên men các nguồn cacbonhydrat
Nguyên tắc:
- Thử khả năng lên men carbohydrate của các chủng vi sinh vật khác nhau. - Những vi sinh vật khác nhau có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau.
Carbohydrate chia làm 3 nhóm:
- Nhóm 1: Monosaccharide, polyhydroxylic, aldehyde hoặc ketone. - Nhóm 2: polysaccharide và oligosaccharide.
- Nhóm 3: polyhydric alcohol và các cycitol.
Lên men: Là quá trình trao đổi chất oxy hóa khử, mà chất nhận điện tử cuối cùng không phải là oxy mà là các cơ chất hữu cơ khác. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men phụ thuộc vào:
- Dòng VSV khác nhau.
- Cơ chất tự nhiên dùng để lên men. - Thời gian, nhiệt độ, pH của môi trường. Phát hiện vi sinh vật có lên men carbohydrate:
- Sản phẩm tạo thành Æ pH môi trường giảm Æ sử dụng chất chỉ thị để phát hiện
- Có sinh hơi
Phát hiện hơi sinh ra như thế nào? - Môi trường lỏng (VSV hiếu khí)
Hình 3.6: Phát hiện vi sinh vật hiếu khí có lên men carbohydrate
- Môi trường đặc (VSV kỵ khí)
Hình 3.7: Phát hiện vi sinh vật kỵ khí có lên men carbohydrate
Cách thực hiện:
- Môi trường sử dụng: phenol red broth base đối với VSV hiếu khí và phenol red agar đối với VSV kỵ khí
- Nguồn carbon: tùy vi sinh vật - Đọc kết quả:
(+): môi trường chuyển sang vàng (-): không đổi màu
Cấy vi khuẩn từ TSA vào các ống canh thang bromcresol có chứa một trong các lọai cacbohydrat: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton, D-
mannoza. Ủ các ống canh thang ở nhiệt độ 37oC. Phản ứng dương tính khi môi trường có màu vàng, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu đỏ.
V. cholerae cho phản ứng sacaroza, manniton, mannoza dương tính và lactoza, cellobioza, arabinoza âm tính.
Hình 3.8: Kết quả thử nghiệm carbohydrate
+ Thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza
Nguyên tắc: xác định khả năng của một vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ các aminoacid như ornithin, lysin hay arginin Æ làm kiềm môi trường nuôi cấy.
Cơ sở sinh hóa:
Lysine DeCarboxylase
Lysine Cadavarine + CO2
Ornithine DeCarboxylase
Ornithine Putrescine + CO2
Arginine DeCarboxylase
Arginine Agmatine Putrescine + CO2
Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithin, lysin, arginin và ống đối chứng không có axit amin. Mỗi ống được phủ 1 - 2 ml dầu khoáng vô
trùng, ủ các ống ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi trường giữ nguyên màu tím hoặc hơi đậm hơn. Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương tự màu của ống đối chứng).
V. cholerae cho phản ứng lysin và ornithin dương tính, phản ứng arginin âm tính.
Hình 3.9: Kết quả thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza
+ Thử nghiệm urê
Mục đích: xác định sự hiện diện của enzyme urease ở vi sinh vật thông qua khả
năng phân hủy urea. Cơ chế:
Urea + H2O CO2 + H2O + NH3
Sản phẩm tạo thành là ammonia carbonat làm đổi màu chất chỉ thị.
Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê, ủở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V.
Hình 3.10:Kết quả thử nghiệm Urea
+ Thử nghiệm ONPG
Để xác định sự hiện của enzyme β-galactosidase.
Xét xem VSV có thể sử dụng lactose như một nguồn carbohydrate.
Hình 3.11: Cơ chế thử nghiệm ONPG
β
Lấy vi khuẩn đã phát triển trên môi trường TSI hoặc từ môi trường không chọn lọc khác có chứa 1,0% lactoza vào ống nghiệm có chứa 0,25 ml nước muối sinh lý, hoà tan. Thêm 1 giọt toluen vào ống rồi lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG, ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37oC. Kiểm tra ống định kỳ trong 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi dung dịch có màu vàng.
Có thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG. Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ
vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý. Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống rồi ủ ấm và đọc kết quả như trên.
Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat. Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl. Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủở nhiệt
độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi Vibriostat tạo một vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa O/129.
Hình 3.12: Kết quả thử nghiệm ONPG
+ Tính ưa mặn (NaCl): cấy chuyển từ TSA vào môi trường canh
trypton (không có NaCl), canh trypton (3% NaCl), canh trypyon (6% NaCl) và canh trypton(8% NaCl), canh trypton (10% NaCl). Ủ qua đêm ở 37oC. Kết quả tính ưa mặn của V.cholerae , V.parahaemolyticus như sau:
Tính ưa mặn
V.cholerae V.parahaemolyticus V.culnificus
0% + - -
3% + + +
6% - + +
8% - + -
10% - - -
+ Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn
O/129Vibriostat
Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl. Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủở nhiệt
độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi Vibriostat tạo một vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa O/129.
+ Thử nghiệm kháng huyết thanh.
Mục đích: xác định các dòng Vibrio khác nhau.
Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ
TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực hiện.
Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae theo Bảng 3.2 và Bảng 3.3
Bảng 3.2. Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1
Kháng nguyên Kháng huyết
thanh đa giá O1
Dung dịch muối sinh lý
Kết luận
Chủng có kết quả
sinh hoá tương tự V. cholerae
+ - V.cholerae O1
Chủng có kết quả
sinh hoá tương tự V. cholerae
- - V.cholerae non- O1
Chủng có kết quả
sinh hoá tương tự V. cholerae
+ + Chủng không đặc hiệu với kháng nguyên O nhóm 1
Bảng 3.3. Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.choleraeO1
Kháng nguyên Kháng huyết thanh Inaba Kháng huyết thanh Ogawa Dung dịch muối sinh lý Kết luận V. cholerae O1 + - - Chủng Inaba V. cholerae O1 - + - Chủng Ogawa V. cholerae O1 + + - Chủng Hikojima V.cholerae O1 - - - Chủng không đặc hiệu
3.1.1.6. Đọc kết quả
Phát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g (10g) mẫu.
3.2. Phương pháp hiện đại
3.2.1. Phương pháp miễn dịch học – Elisa (Enzyme Linked mmunosorbent Assays) mmunosorbent Assays)
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Kỹ thuật ELISA có thểđược sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng do V.harveyi trên tôm, mẫu nước và có thể xác định tất cả các dòng Vibrio spp. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể và gồm các bước cơ bản sau:
-
Kháng nguyên chưa biết được gắn trên một bề mặt.
-
Kháng thể biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme.
-
Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết
định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu.
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate).
Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa.
Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thểđặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra.
Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể có thể sảy ra. Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu
quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ
cấp này.
Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽđược lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ
lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ
chất) sẽ sảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và
độ chính xác của ELISA. Có những phương pháp ELISA như sau:
3.2.1.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA)
Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng (được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.
Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn.
Thêm dung dịch protein không tương tác (non – interacting protein) như
albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể
cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blocking" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của