2.2.7.2 Trên động vật
• Trên tơm
Tơm bị nhiễm Vibrio spp ở trạng thái khơng bình thường, hơn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Tơm có thể nổi lên mặt ao, dạt bờ hay kéo đang bơi lịng vịng. Vỏ tơm bị mềm và xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và các phần phụ.
Hình 2.8: Đi tơm sú bị mịn cụt do nhiễm vi khuẩn Vibrio.
Khi vi khuẩn này cảm nhiễm trên vỏ kitin và mang có thể gây ra các vết thương tổn màu nâu đen do kitin đã bị ăn mòn và viêm nhiễm. Hội chứng này gọi là bệnh vỏ hay bệnh nhiễm nâu. Vỏ tơm có sự biến đổi thành màu đỏ hay màu xanh.
Hình 2.9: Lớp vỏ kitin của tơm mềm và có màu xanh.
• Trên cá
Cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn. Cơ thể có màu đen đặc biệt ở vùng lưng và trên các vết thương tổn; da, vây có thể sưng lên và bị lở loét. Cơ nổi hạch, mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục.
Lớp cơ dưới da có nhiều sắc tố melanin màu đen và thể hiện dấu hiệu hoại tử, có hiện tượng lở loét của lớp biểu bì. Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử này lan nhanh, hoá lỏng và lá lách sẽ có màu đỏ anh đào, rồi mất dần hình dạng ban đầu của
nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng. Các cơ quan bên trong khoang bụng xuất hiện mạch máu nổi rõ lên. Tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu đen.
2.2.8. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam và trên thế giới lạnh ở Việt Nam và trên thế giới
2.2.8.1. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản
đông lạnh ở Việt Nam
Tại Việt Nam, tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản là rất
đáng báo động. Dịch tiêu chảy cấp năm 2007 xảy ra với diễn biến phức tạp và tốc độ lây lan nhanh chóng: Đợt 1 (từ 23/10/2007-6/12/2007): xảy ra tại 14 tỉnh với 259
trường hợp (+) với phẩy khuẩn tả, đợt 2 (24/12/2007-5/2/2008): tại thành phố Hà Nội với 32 trường hợp (+). Dịch tiêu chảy cấp xuất hiện do yếu tố môi trường bị ô nhiễm, nguồn nước bị nhiễm khuẩn, bên cạnh đó cịn một yếu tố nguy cơ gây gia
tăng tỷ lệ nhanh đó chính là việc nhiễm các lọai vi sinh: E.coli, V.chloera,
Clostridium perfringens…của một số loại thức phẩm nguy cơ: các loại mắm, rau
sống, thức ăn đường phố ăn liền, các loại thực phẩm hải sản tươi sống đông lạnh.
Trong năm 2009, cả nước đã xảy ra 147 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó có 5.026 người mắc, 3.938 người đi viện, 33 người tử vong. Vào năm 2010 các vụ ngộ
độc thực phẩm thường xuyên xảy ra ở tập thể như: trong quý III/2010 cả nước đã
có 48 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có 1.627 người mắc, 12 người tử vong, 75
cơng nhân của Xí nghiệp may Global (KCN Tiền Hải, huyện Tiền Hải) bị ngộ độc thực phẩm, Bình thuận 11/6/2010 có 127 du khách bị ngộ độc thực phẩm.
2.2.8.2. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản
đông lạnh trên thế giới
Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng 70% tổng số ca ngộ độc thực phẩm. Tại các nước châu Á Vibrio spp là nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc và các vụ nhiễm Vibrio spp chủ yếu ở các nước Nhật Bản,
Theo thống kê ở Nhật Bản năm 1997 có 1.960 vụ ngộ độc thực phẩm với 39.989 người mắc, ở Úc mỗi ngày có 11.500 người mắc các bệnh cấp tính do ăn uống gây
ra, ở Mỹ hàng năm có đến con số hàng triệu trường hợp ngộ độc thực phẩm.
Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Quốc Tế (WHO) cho biết có 184.311 trường hợp bệnh tả được báo cáo từ 58 quốc gia (95% các quốc gia này thuộc Phi Châu) và có 2.728 người chết do tiêu thụ thức ăn nhiễm Vibrio spp.
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH
3.1. Phương pháp truyền thống
3.1.1. Phương pháp định tính
3.1.1.1. Nguyên tắc.
Một lượng mẫu xác định (10g hoặc 25g) được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng. Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng đỉnh
bằng các phản ứng sinh hóa và huyết thanh học. Môi trường tăng sinh chọn lọc cho
V. cholerae, V. alginolytycus và V. vulnificus là nước peptone kiềm. Trong khi đó
mơi trường Colistine Polymicine Borth thường được dùng để tăng sinh V.
parahaemolyticus. Môi trường thường dùng để phân lập Vibrio là TCBS
(Thiosalphate Citrate Bile Sucrose Agar). Các vi sinh vật len men được sucrose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm acid hóa mơi trường bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật không len men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh. 3.1.1.2. Thiết bị và dụng cụ • Tủ ấm 37oC • Bể điều nhiệt 42oC • Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g • Mấy nghiền đồng thể • Mấy lắc ống nghiệm • Đĩa petri • Ống nghiệm với các kích cỡ 13, 16, 18mm
• Một số thiết bị thơng thường khác như: máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp thanh
trùng, tủ lạnh.
3.1.1.3. Mơi trường và hóa chất
• Canh Colistine Polymicine Broth (Colistine).
• Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose (TCBS Agar). • Canh Tryptone.
• Thạch Kligler Iron (KI).
• Canh Hugh Leifson Glucose (HLG). • Canh Carbohydrate tím.
• Mơi trường thử nghiệm Decarboxylase (Moeller). • Dung dịch oxidase.
• Dung dịch thử nghiệm String (sodium desoxycholate 5%). • Kháng huyết thanh polyvalent O dùng cho V.cholerae. • Kháng huyết thanh O.
• Dung dịch NaOH 1N. • Dung dịch HCl 1N.
• Dung dịch dầu phủ vơ trùng. • Dung dịch Bromocresol tím.
3.1.1.4. Quy trình phân tích.
Dùng que cấy vịng lấy mẫu, cấy ria lên mặt đĩa mơi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn. Ủ trong 18 – 22 giờ.
Khuẩn lạc đặc trưng của Vibrio có hình dạng: KL V.cholerae và V.
alginolyticus lớn, đường kính 2-3mm,láng, màu vàng, hơi phẳng, tâm đục,
có quầng trắng đục xung quanh. Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V.
vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh dương.
25g mẫu + 225ml canh tăng sinh chọn lọc (APW) đồng nhất trong 30 giây độ pha loãng 10-1
Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang môi trường không chọn lọc T1N1 (3% NaCl) hoặc TSA bổ sung 3% NaCl. Đem ủ 37 oC trong 18- 24h.
Thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng huyết thanh.
Kết luận.
Phát hiện hay không phát hiện Vibrio trong 25g (10g) mẫu.
3.1.1.5. Thuyết minh quy trình
Ư Chuẩn bị mẫu
Cân chính xác 25g (10g) mẫu cho vào bao PE vơ trùng, sau đó thêm 225ml (90ml) dung dịch pha loãng mẫu APW. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian dập mẫu là 30 giây. Tất cả các thao tác phải thực hiện trong điều kiện vơ trùng.
Ư Tăng sinh chọn lọc
Dùng nước peptone kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường hợp V.cholerae và V.
alginolyticus, V. vulnificus.
Dùng canh Colistine cho trường hợp V.parahaemolyticus. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
Ö Phân lập
Sau 24 giờ, dùng que cấy vịng lấy một ít sinh khối trên môi trường APW và cấy lên bề mặt đĩa môi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 37oC trong 18 – 22 giờ. Hình dạng khuẩn lạc đặc trưng của các lồi Vibrio trên mơi trường này
như sau: khuẩn lạc V.cholerae và V. alginolyticus lớn, đường kính 2-3mm, láng, màu vàng, hơi phẳng, tâm đục, có quầng trắng đục xung quanh. Khuẩn lạc
V.parahaemolyticus và V. vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh
dương.
Hình 3.2: Phân lập Vibrio trên mơi trường MacConkey
Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp trên môi trường TCBS
Tiếp theo, cấy chuyền sinh khối từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập TCBS thạch sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl, ủ 37 oC trong 18- 24h để thu sinh khối sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa.
Ư Thử nghiệm sinh hóa
Thử nghiệm sinh hóa quan trọng để phát hiện hay phân biệt các lồi Vibrio là: quan sát tính di dộng trên kính hiển vi, quan sát sự di động trên thạch mềm và các thử nghiệm khác.
Bảng 3.1. Các đặc điểm sinh hóa của Vibrio cholerea và Vibrio parahaemolyticus Thử nghiệm sinh hóa Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerea ONPG (-) (+) Lactose (-) (-) ADH (-) (-) LDC (+) (+) TDA (-) (-) Indol (+) (+) Manose (+) (+) Sucrose (-) (+) Oxidase (+) (+) NaCl 0% (-) (+) NaCl 3% (+) (+) NaCl 6% (+) (-) NaCl 8% (+) / (-) (-) NaCl 10% (-) (-)
+ Thử nghiệm trên môi trường TSI, KIA
Nhằm xác định vi sinh vật sử dụng các nguồn carbohydrate nào, có sinh ga hay khơng, có sinh H2S hay khơng.
Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống thạch nghiêng TSI hoặc KIA. Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Ni ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ.
Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S. Trên mơi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và không
sinh H2S.
Hình 3.4: Kết quả thử nghiệm TSI/ KIA
+ Thử nghiệm với các canh thang trypton muối
Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 %. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ, rồi
ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong ống
canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 3% và làm đục môi trường.
+ Thử nghiệm lên men - oxy hoá
Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson glucoza hoặc O/F glucoza. Phủ khoảng 1 - 2 ml dầu khống vơ trùng vào một trong 2 ống, ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37oC trong 1 - 2 ngày.
V. cholerae lên men glucoza làm mơi trường Hugh - Leifson từ màu tím chuyển
thành vàng và môi trường O/F từ màu xanh thành vàng.
+ Thử nghiệm oxidaza
Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt thuốc thử oxidaza.
Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc que gỗ vô trùng lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử oxidaza. V. cholerae làm vết ria có màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây . Chú thích: khơng dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này.
+ Nhuộm gram
Kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn, với thành phần thuốc nhuộm gồm có tím gentian, dung dịch lugol, Fucsin kiềm bằng cách cố định tiêu bản sau đó nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên trong 2 phút,
rửa nước, sau đó nhỏ dung dịch lugol lên trong 2 phút, hất đi, tẩy mầu bằng cồn 90o tới khi bạc màu, rửa nước, nhỏ dung dịch Fucsin kiềm ( pha loãng tỷ lệ 1/10 ) lên trong 1/2 phút, rửa nước, để tiêu bản khô trong không khí hoặc dùng giấy thấm, soi tiêu bản bằng vật kính dầu.
Nhận biết vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, có hình thể mảnh, cong, hình dấu phẩy, khơng có vỏ, khơng sinh nha bào, khi ni cấy lâu ngày sẽ có sự thay đổi về hình thể so với ban đầu.
V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.
+ Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 420C
Cấy vi khuẩn từ TSA vào một ống canh thang trypton 1% NaCl. Ủ ở nhiệt độ
42oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 42oC làm môi trường bị đục.
+ Thử nghiệm lên men các nguồn cacbonhydrat
Nguyên tắc:
- Thử khả năng lên men carbohydrate của các chủng vi sinh vật khác nhau. - Những vi sinh vật khác nhau có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau.
Carbohydrate chia làm 3 nhóm:
- Nhóm 1: Monosaccharide, polyhydroxylic, aldehyde hoặc ketone. - Nhóm 2: polysaccharide và oligosaccharide.
- Nhóm 3: polyhydric alcohol và các cycitol.
Lên men: Là q trình trao đổi chất oxy hóa khử, mà chất nhận điện tử cuối
cùng không phải là oxy mà là các cơ chất hữu cơ khác. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men phụ thuộc vào:
- Dòng VSV khác nhau.
- Cơ chất tự nhiên dùng để lên men. - Thời gian, nhiệt độ, pH của mơi trường. Phát hiện vi sinh vật có lên men carbohydrate:
- Sản phẩm tạo thành Ỉ pH mơi trường giảm Ỉ sử dụng chất chỉ thị để phát hiện
- Có sinh hơi
Phát hiện hơi sinh ra như thế nào? - Mơi trường lỏng (VSV hiếu khí)
Hình 3.6: Phát hiện vi sinh vật hiếu khí có lên men carbohydrate
- Mơi trường đặc (VSV kỵ khí)
Hình 3.7: Phát hiện vi sinh vật kỵ khí có lên men carbohydrate
Cách thực hiện:
- Môi trường sử dụng: phenol red broth base đối với VSV hiếu khí và phenol red agar đối với VSV kỵ khí
- Nguồn carbon: tùy vi sinh vật - Đọc kết quả:
(+): môi trường chuyển sang vàng (-): không đổi màu
Cấy vi khuẩn từ TSA vào các ống canh thang bromcresol có chứa một trong các lọai cacbohydrat: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton, D-
mannoza. Ủ các ống canh thang ở nhiệt độ 37oC. Phản ứng dương tính khi mơi
trường có màu vàng, âm tính khi mơi trường giữ nguyên màu đỏ.
V. cholerae cho phản ứng sacaroza, manniton, mannoza dương tính và lactoza,
cellobioza, arabinoza âm tính.
Hình 3.8: Kết quả thử nghiệm carbohydrate
+ Thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza
Nguyên tắc: xác định khả năng của một vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ các aminoacid như ornithin, lysin hay arginin Ỉ làm kiềm môi trường nuôi cấy.
Cơ sở sinh hóa:
Lysine DeCarboxylase
Lysine Cadavarine + CO2
Ornithine DeCarboxylase
Ornithine Putrescine + CO2
Arginine DeCarboxylase
Arginine Agmatine Putrescine + CO2
Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithin, lysin, arginin và ống đối chứng khơng có axit amin. Mỗi ống được phủ 1 - 2 ml dầu khống vơ
trùng, ủ các ống ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. Phản ứng dương tính khi mơi
trường giữ nguyên màu tím hoặc hơi đậm hơn. Phản ứng âm tính khi tồn bộ ống
canh thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương tự màu của ống đối chứng).
V. cholerae cho phản ứng lysin và ornithin dương tính, phản ứng arginin âm
tính.
Hình 3.9: Kết quả thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza
+ Thử nghiệm urê
Mục đích: xác định sự hiện diện của enzyme urease ở vi sinh vật thông qua khả năng phân hủy urea.
Cơ chế:
Urea + H2O CO2 + H2O + NH3 Sản phẩm tạo thành là ammonia carbonat làm đổi màu chất chỉ thị.
Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V.
Hình 3.10:Kết quả thử nghiệm Urea
+ Thử nghiệm ONPG
Để xác định sự hiện của enzyme β-galactosidase.
Xét xem VSV có thể sử dụng lactose như một nguồn carbohydrate.
Hình 3.11: Cơ chế thử nghiệm ONPG
β
Lấy vi khuẩn đã phát triển trên môi trường TSI hoặc từ mơi trường khơng chọn lọc khác có chứa 1,0% lactoza vào ống nghiệm có chứa 0,25 ml nước muối sinh lý, hoà tan. Thêm 1 giọt toluen vào ống rồi lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG, ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37oC. Kiểm tra ống định kỳ trong 24
giờ. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi dung dịch có màu vàng.
Có thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG. Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý. Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống rồi ủ ấm và đọc kết quả như trên.
Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat. Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl. Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt
độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi
Vibriostat tạo một vịng vơ khuẩn xung quanh các đĩa O/129.