Chƣơng 2 : THỰC NGHIỆM
2.2.Tổng hợp các phức chất rắn
Phức chất rắn của Ln3+
được điều chế theo sơ đồ sau:
0
HCl Ala 2 3 3 40 C
Ln O LnCl Phức chất của Ln3+
Trộn 1 mmol LnCl3 và 3 mmol Ala ở dạng rắn trong cốc chịu nhiệt, sau đó cho 30 ml metanol vào được hỗn hợp ở dạng huyền phù. Khuấy hỗn hợp phản ứng bằng máy gia nhiệt ở 400C trong 8h thu được dung dịch trong suốt. Làm lạnh từ từ hỗn hợp phản ứng đến nhiệt độ phịng, kết tủa phức chất có màu đặc trưng của ion đất hiếm sẽ xuất hiện từ từ. Lọc lấy kết tủa và làm khơ sản phẩm trong bình hút ẩm.
2.3. Xác định thành phần, cấu tạo các phức chất rắn thu đƣợc
2.3.1. Xác định thành phần của các phức chất
Xác định hàm lượng (%) NTĐH
Hàm lượng của Ln trong các phức chất được xác định bằng phương pháp chuẩn độ complexon.
Cách tiến hành: cân một lượng xác định phức chất rồi đem nung ở 9000 C trong vòng 1h, hòa tan oxit thu được bằng axit HCl 1N, được dung dịch LnCl3, cô cạn trên bếp cách thủy ở 800C để đuổi hết axit dư, tiếp tục hòa tan bằng nước cất hai
lần và định mức đến thể tích nhất định, tiến hành chuẩn độ xác định nồng độ dung dịch LnCl3 bằng dung dịch chuẩn DTPA 10-3M với chất chỉ thị asenazo(III) 0,1%.
Hàm lượng % Ln được tính theo cơng thức: 3 Ln LnCl phuc M .N .V %Ln = .100% m Trong đó:
mphức: khối lượng phức chất đem nung (g). MLn: khối lượng phân tử của NTĐH (g.mol-1
). 3 LnCl N : nồng độ muối LnCl3 (M). V = 0,1(l).
Lặp lại thí nghiệm hai lần với khối lượng phức chất khác nhau rồi lấy kết quả trung bình. Kết quả xác định hàm lượng % Ln trong phức chất theo phương pháp chuẩn độ complexon được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Kết quả xác định hàm lượng (%) Ln trong các phức chất
Công thức giả thiết mphức(g) Ln (%)
TN1 TN2 TN1 TN2 [Tb(Ala)3]Cl3.3H2O 0,0768 0,0822 27,85 27,17 [Dy(Ala)3]Cl3.3H2O 0,0766 0,0591 27,24 27,48 [Ho(Ala)3]Cl3.3H2O 0,0588 0,0768 27,05 27,58 [Er(Ala)3]Cl3.3H2O 0,0589 0,0768 27,14 27,43 [Tm(Ala)3]Cl3.3H2O 0,0791 0,0649 27,36 27,28
(Ln: Tb, Dy, Ho, Er, Tm; TN: Thí nghiệm)
Xác định hàm lượng (%) cacbon, nitơ
Hàm lượng (%) cacbon, nitơ trong phức chất được phân tích trên máy phân tích đa nguyên tố Truspec CNS Leco (Mỹ), tại Viện Khoa học Sự sống, Đại học Thái Nguyên, nguyên tắc hoạt động của máy dựa theo phương pháp Dusmas.
Xác định hàm lượng (%) clo bằng phương pháp Mohr
Việc xác định hàm lượng clo trong phức chất được tiến hành như sau: Cân một lượng xác định phức chất, hịa tan hồn tồn và định mức đến thể tích nhất định. Sử dụng phương pháp Mohr để xác định hàm lượng ion Cl-
trong dung dịch, với chất chuẩn là AgNO3 0,1M, chỉ thị K2CrO4 5%. Hàm lượng clo được tính theo cơng thức sau:
%Cl = .100% . . . . 2 1 3 3 a V M V C VAgNO AgNO Cl Trong đó:
CAgNO3: nồng độ của dung dịch chuẩn AgNO3 (M). VAgNO3: thể tích của AgNO3 đã chuẩn độ (ml). V1: thể tích dung dịch phức đã định mức (ml). V2: thể tích dung dịch phức đem chuẩn độ (ml). a: khối lượng phức chất đem hòa tan (mg).
Lặp lại thí nghiệm hai lần với khối lượng phức chất khác nhau rồi lấy kết quả trung bình. Kết quả xác định hàm lượng %Cl trong phức chất theo phương pháp Morh được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Kết quả xác định hàm lượng %Cl trong các phức chất
Công thức giả thiết mphức(g) Cl(%)
TN1 TN2 TN1 TN2 [Tb(Ala)3]Cl3.3H2O 0,0536 0,0460 18,18 17,42 [Dy(Ala)3]Cl3.3H2O 0,0457 0,0546 17,45 17,85 [Ho(Ala)3]Cl3.3H2O 0,0546 0,0461 17,85 17,30 [Er(Ala)3]Cl3.3H2O 0,0454 0,0508 17,57 17,45 [Tm(Ala)3]Cl3.3H2O 0,0415 0,0496 17,08 17,87 2.3.2. Độ dẫn điện của các phức chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngay sau khi pha dung dịch DL-alanin và các dung dịch phức chất ở
dung dịch trên máy FIGURE7 của Mỹ. Hiệu chỉnh điện cực của máy bằng dung dịch chuẩn NaCl nồng độ 692 ppm và 7230 ppm (các dung dịch chuẩn có kèm theo máy). Kết quả được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Độ dẫn điện riêng (χ, om-1.cm-1.10-6) của các dung dịch ở 250C
Dung dịch ( 10-3 M ) χ (om-1 .cm-1.10-6) DL-alanin 3,7 [Tb(Ala)3]Cl3.3H2O 392 [Dy(Ala)3]Cl3.3H2O 417 [Ho(Ala)3]Cl3.3H2O 431 [Er(Ala)3]Cl3.3H2O 411 [Tm(Ala)3]Cl3.3H2O 391
2.4. Thăm dò ảnh hƣởng của một số phức chất rắn tổng hợp đƣợc đến sự nảy mầm, phát triển mầm và một số chỉ tiêu sinh hóa của mầm hạt đậu đen
2.4.1. Xây dựng đường chuẩn xác định một số chỉ tiêu sinh hóa
Xác định protein theo phương pháp Lowry, hoạt độ proteaza theo phương pháp Anson cải tiến, hoạt độ α-amilaza theo phương pháp Wohlgemuth [1]. Để xác định protein, proteaza, α-amilaza, chúng tôi tiến hành xây dựng các đường chuẩn.
Xây dựng đường chuẩn xác định protein
Dùng ống hút lấy 0,1÷0,5 ml dung dịch protein huyết thanh bò (0,5 mg/ml) cho vào 5 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 5. Cho vào mỗi ống 5 ml dung dịch D (gồm 48 ml dung dịch Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N, 1 ml dung dịch CuSO4 0,5% và 1ml dung dịch NaKC4H4O6 1%), thêm nước cất đến cùng thể tích là 9 ml. Lắc đều, để yên 15 phút, bổ sung vào mỗi ống 1 ml dung dịch E (thuốc thử Folin-Ciocalto pha loãng với nước cất tỉ lệ 1:1), lại lắc đều và để yên 30 phút.
Mẫu so sánh khơng có protein: 5 ml dung dịch D, 4 ml nước và 1 ml dung dịch E.
Đo độ hấp thụ quang A của các dung dịch ở bước sóng 750 nm [1]. Kết quả được trình bày ở bảng 2.4 và hình 2.1.
Bảng 2.4. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào khối lượng protein
Mẫu 1 2 3 4 5
Khối lượng protein
(huyết thanh bò) (mg) 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 A750 0,0601 0,0986 0,1331 0,1821 0,2153 y = 0.7878x + 0.0197 R2 = 0.9968 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 mg protein M ật độ qu ang
Hình 2.1. Đường chuẩn xác định protein
Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt độ proteaza
Dùng ống hút lấy những thể tích xác định dung dịch chuẩn tyrosin 1μmol/ml cho vào các bình định mức cỡ 25 ml. Dùng dung dịch HCl 0,2N pha loãng đến vạch để được các dung dịch tyrosin có nồng độ 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 μmol/ml. Lấy 1ml ở mỗi ống nghiệm trên cho vào 5 ống nghiệm có đánh số thứ tự, thêm vào mỗi ống 4 ml dung dịch Na2CO3 6%. Lắc đều, thêm vào 1ml thuốc thử Folin-Ciocalto đã pha loãng 5 lần, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Mẫu so sánh khơng có tyrosin: 1 ml nước cất, 4 ml dung dịch Na2CO3 6% và 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalto.
Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 750 nm [1]. Kết quả được trình bày ở bảng 2.5 và hình 2.2.
Độ h
ấp thụ
qua
Bảng 2.5. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào nồng độ tyrosin
Mẫu 1 2 3 4 5
Tyrosin (μmol/ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10
A750 0,0504 0,0917 0,1377 0,1866 0,2421
Hình 2.2. Đường chuẩn xác định proteaza
Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt độ α-amilaza
Dùng ống hút lấy 2, 4, 6, 8, 10ml dung dịch tinh bột 1% cho vào 5 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 1 đến 5, thêm nước cất đến 10ml. Lấy 0,1ml dung dịch tinh bột ở mỗi ống nghiệm trên cho vào 5 ống nghiệm khác, thêm vào đó 0,1ml dung dịch NaCl 0,1%; 0,2ml dung dịch đệm photphat pH=6; 0,1ml nước cất và 0,5ml dung dịch axit sunfosalisilic 20%. Lắc đều và thêm vào 3ml dung dịch iốt đã pha loãng 150 lần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch so sánh có thành phần tương tự nhưng khơng có tinh bột.
Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 560nm [1]. Kết quả được trình bày ở bảng 2.6 và hình 2.3.
Bảng 2.6. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào khối lượng tinh bột
Mẫu 1 2 3 4 5
Khối lượng tinh bột (mg) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
A560 0,08 0,19 0,28 0,37 0,48 µmol tyrosin Độ h ấp thụ qua ng
y = 0.49x - 0.014 R2 = 0.9983 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 mg tinh bột m ật độ qu ang
Hình 2.3. Đường chuẩn xác định α-amilaza
2.4.2. Ảnh hưởng của hàm lượng các phức chất [Tb(Ala)3]Cl3.3H2O và [Er(Ala)3]Cl3.3H2O đến sự nảy mầm và phát triển mầm của hạt đậu đen [Er(Ala)3]Cl3.3H2O đến sự nảy mầm và phát triển mầm của hạt đậu đen
Thăm dò ảnh hưởng của hàm lượng phức chất đến sự nảy mầm và phát triển mầm của hạt đậu đen
Chọn 6 mẫu hạt đậu đen (cho mỗi phức), mỗi mẫu 50 hạt kích thước tương đối đồng đều (khối lượng 6,32±0,01 g). Ngâm hạt trong các dung dịch phức chất có nồng độ 30, 60, 120, 180, 240 ppm (tính theo hàm lượng của ion Ln3+; mẫu so sánh ngâm trong nước cất). Thể tích các dung dịch phức chất và nước cất đem ngâm là 100 ml. Sau thời gian 24 giờ vớt ra và ủ hạt trong cốc cỡ 500 ml, được lót dưới và đậy trên bằng giấy lọc, để trong tủ ấm ở 300
C. Các dung dịch ngâm được thu hồi để ngâm mầm lại lần sau. Hàng ngày ngâm hạt bằng các dung dịch phức và nước cất theo thứ tự các mẫu, ngày ngâm 3 lần, mỗi lần 30 phút.
Sau khi ủ hạt được 1 ngày, chúng tôi đếm số hạt nảy mầm từ đó tính tỉ lệ nảy mầm của hạt. Khi mầm hạt phát triển được 4 ngày tuổi chúng tôi tiến hành đo chiều cao của mầm và độ dài của rễ.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.6, 3.7, 3.8 và hình 3.7.
Độ h
ấp thụ
qua
So sánh ảnh hưởng của các phức chất, muối và phối tử đến sự nảy mầm và phát triển mầm của hạt đậu đen
Tiến hành thí nghiệm với các mẫu : Mẫu 1: H2O.
Mẫu 2: Dung dịch phức chất nồng độ 120 ppm (tính theo hàm lượng của ion Ln3+). Mẫu 3: Dung dịch muối nồng độ 120 ppm (tính theo hàm lượng của ion Ln3+). Mẫu 4: Dung dịch DL-alanin nồng độ 360 ppm.
Sau khi ủ hạt được 1 ngày, chúng tôi đếm số hạt nảy mầm từ đó tính tỉ lệ nảy mầm của hạt. Khi mầm hạt phát triển được 4 ngày tuổi chúng tôi tiến hành đo chiều cao của mầm và độ dài của rễ.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.9, 3.10 và hình 3.8.
2.4.3. Thăm dị ảnh hưởng của hàm lượng phức chất đến một số chỉ tiêu sinh hóa của mầm hạt đậu đen của mầm hạt đậu đen
Cân mỗi mẫu 3 gam giá đậu đen nghiền bằng cối chày sứ, thêm vào 50 ml dung dịch đệm photphat có pH = 6. Trộn đều, sau đó để trong tủ lạnh trong 10 giờ ở 4oC lọc và li tâm, lấy phần dịch trong. Dịch này đem xác định một số chỉ tiêu sinh hóa: protein, proteaza và α-amilaza
Thăm dò ảnh hưởng của các phức chất đến hàm lượng protein của mầm hạt đậu đen
Lấy mỗi mẫu 0,2 ml dịch chiết cho vào các ống nghiệm có đánh số, thêm vào mỗi ống nghiệm 5 ml dung dịch D, bổ sung thêm nước cất đến cùng thể tích 9 ml, lắc đều, để yên 15 phút. Sau đó lại thêm vào mỗi ống 1 ml dung dịch E, lắc đều và tiếp tục để yên 30 phút.
Mẫu so sánh khơng có dịch chiết: 5 ml dung dịch D, 4 ml nước và 1 ml dung dịch E.
Đo độ hấp thụ quang của các mẫu thí nghiệm ở bước sóng 750 nm [1]. Đối chiếu với đường chuẩn protein, tính số mg protein có trong mỗi mẫu. Hàm lượng protein được tính theo cơng thức:
X= 100%
m HSPL a (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó:
X: Hàm lượng protein (% khối lượng khô). a: Số đo trên máy (mg/ml).
HSPL: Hệ số pha loãng. m: Khối lượng mẫu (mg).
Thăm dò ảnh hưởng của các phức chất đến hàm lượng proteaza của mầm hạt đậu đen
Cho vào mỗi ống nghiệm có đánh số thứ tự 2 ml dung dịch tyrosin 1μmol/ml , 1 ml dịch chiết của từng mẫu, lắc đều, để yên ở 300
C trong 10 phút. Thêm vào mỗi ống 5 ml axit tricloaxetic 5%, lắc đều, tiếp tục giữ ở 300
C trong 30 phút.
Mẫu kiểm tra làm tương tự như trên nhưng cho dung dịch axit tricloaxetic 5% vào trước. Mẫu so sánh thay 2 ml dung dịch tyrosin 1μmol/ml bằng nước cất.
Cho vào các ống nghiệm khác 1 ml dung dịch lọc của mỗi mẫu thí nghiệm, mẫu kiểm
tra và mẫu so sánh, thêm vào mỗi ống 4 ml dung dịch Na2CO3 6% và 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalto đã pha loãng 5 lần, lắc đều và giữ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Đo độ hấp thụ quang của các mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra ở bước sóng 750 nm. Đối chiếu với đường chuẩn proteaza tính lượng μmol tyrosin tương ứng. Từ đó tính đơn vị hoạt độ (ĐVHĐ) của proteaza theo công thức:
ĐVHĐ/ml = m t HSPL k n ) ( Trong đó:
n: Số đo trên máy mẫu thí nghiệm (mg/ml). k: Số đo trên máy mẫu kiểm tra (mg/ml). HSPL: Hệ số pha loãng.
t: Thời gian ủ enzim với cơ chất (phút). m: Khối lượng mẫu (mg).
Thăm dò ảnh hưởng của các phức chất đến đến hàm lượng α-amilaza của
mầm hạt đậu đen
Cho vào mỗi ống nghiệm có đánh số thứ tự 1ml dung dịch tinh bột 1%, 1ml dung dịch NaCl 0,1%, 2ml dung dịch đệm photphat 0,05M (pH= 6), lắc đều và giữ ở 30oC trong 15 phút , thêm vào mỗi hỗn hợp 1ml dung dịch chiết của từng mẫu, lắc đều và tiếp tục giữ ở 30oC trong 30 phút sau đó cho 5ml dung dịch axit sunfusalisilic 20%.
Mẫu so sánh gồm 1ml dung dịch chiết của mỗi mẫu thí nghiệm, 9ml dung dịch iốt đã pha loãng 150 lần.
Đo mật độ quang A của các dung dịch ở bước sóng 560 nm [1]. Tính đơn vị hoạt độ (ĐVHĐ) của α-amilaza theo cơng thức:
ĐVHĐ/ml = m HSPL n k ) ( Trong đó:
n: Số đo trên máy mẫu thí nghiệm (mg/ml). k: Số đo trên máy mẫu kiểm tra (mg/ml). HSPL: Hệ số pha loãng.
m: Khối lượng mẫu (mg).
Kết quả xác định hàm lượng protein, hoạt độ proteaza và α-amilaza của mầm hạt đậu đen (đã được xử lí bằng các phức chất ở các nồng độ khác nhau) được trình bày ở bảng 3.11 và 3.12.
Thăm dò ảnh hưởng của các phức chất, muối và phối tử đến một số chỉ tiêu sinh hóa của mầm hạt đậu đen
Cách tiến hành tương tự như phương pháp thăm dò sự ảnh hưởng của phức chất đến đến một số chỉ tiêu sinh hóa của mầm hạt đậu đen.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tổng hợp các phức chất rắn
Qua tra cứu tài liệu [24], [31] chúng tôi tiến hành tổng hợp phức chất từ chất ban đầu là LnCl3 với tỷ lệ mol LnCl3 : Ala tương ứng là 1 : 3, nhiệt độ phản ứng là 400C, thời giản phản ứng là 8h. Kết quả tổng hợp các phức chất được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả tổng hợp các phức chất rắn STT LnCl3 (g) Ala (g) Khối lượng sản phẩm (g) Dạng bề ngoài
của sản phẩm Hiệu suất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 TbCl3 0,2435 0,2539 0,4105 Bột, trắng 83%
2 DyCl3 0,2581 0,2566 0,4213 Bột, trắng 82%
3 HoCl3 0,2496 0,2459 0,3841 Bột, vàng nhạt 78% 4 ErCl3 0,2572 0,2459 0,3841 Bột, hồng nhạt 80%
5 TmCl3 0,2478 0,2406 0,4147 Bột, trắng 85%
Hiệu suất tổng hợp các phức chất được xác định theo khối lượng phức chất rắn thu được và khối lượng tính theo cơng thức giả thiết [Ln(Ala)3]Cl3.3H2O.
Các phức chất thu được có màu giống màu của ion đất hiếm tương ứng, dễ chảy rữa trong khơng khí ẩm, tan tốt trong nước. Hiệu suất tổng hợp các phức chất xấp xỉ 80%.
3.2. Xác định thành phần, cấu tạo các phức chất rắn thu đƣợc
3.2.1. Hàm lượng các nguyên tố (Ln, C, N, Cl) trong các phức chất
Kết quả xác định hàm lượng % nguyên tố trong các phức rắn được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả phân tích thành phần (%) các nguyên tố (Ln, C, N, Cl) trong các phức chất STT Công thức giả thiết KL phân tử Ln C N Cl LT TN LT TN LT TN LT TN 1 [Tb(Ala)3]Cl3.3H2O 586,61 27,09 26,46 18,43 17,70 7,16 6,88 18,13 17,76 2 [Dy(Ala)3]Cl3.3H2O 590,19 27,42 27,36 18,32 17,59 7,12 6,72 18,02 17,65 3 [Ho(Ala)3]Cl3.3H2O 592,62 27,83 27,32 18,24 17,62 7,09 6,85 17,95 17,58 4 [Er(Ala)3]Cl3.3H2O 594,95 28,11 27,29 18,17 17,58 7,06 6,83 17,88 17,51 5 [Tm(Ala)3]Cl3.3H2O 596,62 28,32 27,32 18,12 17,45 7,04 6,78 17,83 17,48
(Ln: Tb, Dy, Ho, Er, Tm; LT: lí thuyết; TN: thực nghiệm)
So sánh các số liệu về hàm lượng % nguyên tố tính theo cơng thức giả thiết và số liệu phân tích đối với từng nguyên tố trong mỗi phức chất có thể kết luận rằng các phức chất thu được có thành phần phù hợp với công thức giả thiết