2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô lan
2.3.2 Môi trường nuôi cấy lan
Thường môi trường nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng tương ựối ựơn giản. Mơi trường khống MS (1962) có bổ sung chất ựiều hòa tăng trưởng BA 1mg/l và NAA 0,1 mg/l. Ngoài ra các chất chiết từ trái cây cũng ựược sử dụng như nước dừa 10%, khoai tây [10], [43]. Sau 10-12 tuần nuôi cấy, các ựỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn nhỏ gọi PLB (protocorm like body). để có ựược số lượng lớn PLB làm nguồn mẫu ựể phục vụ sản xuất. Các PLB này ựược tách ra thành những cụm nhỏ và cấy sang môi trường kắch thắch nhân nhanh PLB, tuy nhiên chúng cũng dễ dàng tái sinh chồi ngay trên chắnh mơi trường nhân nhanh. để có cây con hồn chỉnh cần tách các chồi riêng lẻ rồi cấy lên môi trường kắch thắch ra rễ, cây con có thể xuất vườn sau 4- 5 tháng nuôi cấy [43].
Năm 1960, Morel ựã tạo ựược cây Cymbidium sạch virus từ cây bị bệnh
bằng nuôi cấy chồi nách trên môi trường Knudson ựặc (công nghiệpẦ). Năm 1963, Donald E. Vimber ựã nghiên cứu trên giống Cymbidium nhưng lại cấy mô phân sinh trên môi trường lỏng và cũng cho kết quả tốt, tạo ra hàng trăm cây con từ một mô nuôi cấy trong thời gian từ 4 Ờ 5 tháng [17], [43].
Năm 1966, Yonco Sagawa và T. Shoji ựã nuôi cấy mô phân sinh ựỉnh và mô phân sinh bên của Cymbidium trên cùng lúc hai môi trường lỏng và ựặc
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ23
(dùng VW hoặc Knudson C). Kết quả là mô cấy lớn lên rất nhanh. Chỉ sau 4 Ờ 6 tuần sẽ xuất hiện các thể giống protocorm (PLBs), sau đó cấy chuyển sang các mơi trường mới. Từ các PLBs có thể tái sinh thành cây [43].
Năm 1967, Robert M. Seulli JR ựã nuôi cấy mô phân sinh ngọn và mô phân sinh bên của giống Cattleya trên môi trường VW + 25% nước dừa và môi trường Morel + 10% nước dừa + 1ppm NAA. Kết quả là cây hình thành trong thời gian từ 6 Ờ 8 tuần [19]. Cũng năm 1967, Yoneo Sagawa, T. Shoji cũng nuôi cấy mô phân sinh ngọn và mô phân sinh bên của giống Dendrobium trên môi
trường Knudson lỏng + 5% nước dừa và Knudson ựặc + 1ppm NAA. Kết quả là mô phân sinh ngọn cho kết quả rất tốt, mô phân sinh bên ở phần cuối thân cho kết quả tốt trên môi trường Knudson C. Cịn mơ cấy từ cuống non không tạo PLBs [18], [19].
Năm 1972, John Kunisaki, Kang-Kwum kim, Yoneo Sagawa ựã cấy ựỉnh sinh trưởng Vanda lá trịn trên mơi trường WV ựặc hay lỏng có bổ sung 15% nước dừa và 10% saccarose. Kết quả là các cơ quan nuôi cấy mô tăng nhanh và phát triển thành cây non có rễ và có thể ựem ra chậu chung [13].
Năm 2008, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, đỗ đức Thịnh, Hoàng Minh Tú ựã nhân giống ựịa lan Hồng Hồng, các chồi non có kắch thước 4 Ờ 6cm hoặc hạt ựược sử dụng làm mẫu cấy, môi trường tối ưu ựể khởi ựộng mẫu chồi là MS + 2% saccarose + 0,65% agar + 1,5ppm BAP hoặc 2ppm Kinetin/lit, môi trường gieo hạt là MS + 1% saccarose + 0,1% peptone + 0,1% than hoạt tắnh + 0,65% agar/lit. Mơi trường thắch hợp nhất ựể nuôi cấy lát mỏng ựã xác ựịnh là: MS + 1ppm Kinetin + 2% saccarose. Môi trường thắch hợp nhất ựể nhân giống là: MS + 2% saccarose + 1ppm Kinetin (hoặc 0,5ppm BAP) + 0,65% agar. Nghiên cứu ựã xác ựịnh được mơi trường tối thắch để tạo cây hồn chình lả MS + 0,1% than hoạt tắnh + 2,5% saccarose [46].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ24
Theo Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Lê Văn Vy, Hồng Minh Tú (Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội) thực hiện nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nuôi trồng cây ựịa lan (Cymbidium spp.) cấy mô. Nghiên cứu tiến hành với 4 giống ựịa lan Xanh Chiểu, Trung Quốc Xanh, Hồng Hoàng và Bạch Ngọc. Kết quả ựã xác ựịnh ựược thời gian ựưa cây ra ngoài vườn ươm tốt nhất ở vùng ựồng bằng là từ tháng 1 ựến tháng 5, từ tháng 9 ựến tháng 12 và vùng núi là từ tháng 3 ựến tháng 10. Giá thể cho tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng phát triển tốt khi ựưa ra vườn ươm là dớn Ờ xơ dừa tỷ lệ 1:1. Chế ựộ phân bón luân phiên hợp lý có tác dụng tốt ựến sự sinh trưởng phát triển của cây so với bón ựơn ựộc một loại phân bón. Chế ựộ phân bón tốt nhất cho cây vườn ươm là 5 lần NPK (30:10:10) + 1 lần NPK (20:20:20) + 1 lần dung dịch sữa cá + 1 lần vitamin tổng hợp. Trong các công thức phối trộn giá thể thì cơng thức giá thể: 1/2 rễ cây dương xỉ + 1/4 ựất mùn + 1/4 phân dê là tốt nhất. để cây phát triển hài hịa cân đối thì cơng thức phân bón tốt nhất dùng cho cây ngồi vườn sản xuất là: 3 lần NPK (20:20:20) + 1 lần NPK (30:10:10) + 1 lần dung dịch hữu cơ sữa cá + 1 lần vitamin tổng hợp. Xử lý KH2PO4 có tác dụng tắch cực ựến sự tăng số lượng ngồng hoa hình thành so với ựối chứng [35], [54].
Theo Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Hồng Minh Tú (2004), quy trình nhân giống địa lan bằng kỹ thuật nuôi cấy mô cho kết quả là: chồi bên có kắch thước 3 Ờ 5cm là cơ quan thắch hợp nhất ựưa vào ni cấy tạo vật liệu khởi ựầu cho q trình nhân giống vơ tắnh. Mơi trường nuôi cấy tạo vật liệu khởi ựầu thắch hợp là MS + 100ml nước dừa + 10g saccarose + 1,5ppm BA + 6,5g agar/lắt [34].
Phương pháp ni cấy lớp mỏng tế bào có hiệu quả rất cao ựối với việc nhân nhanh, kắch thước lát mỏng tối ưu cho ni cấy có tỷ lệ sống và phát sinh hình thái cao là 0,3 Ờ 0,5mm. Bằng phương pháp này có tác dụng thúc ựẩy mạnh mẽ sự phát sinh thể protocorm, có thể thu ựược 27 hay 30 thể protocorm từ một
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ25
protocorm ban ựầu sau 8 tuần nuôi cấy. Môi trường xác ựịnh ựược ựể nuôi cấy lớp mỏng là MS + 15% nước dừa + 1ppm Kinetin (hoặc 0,5ppm BAP) + 10g saccarose + 6,5g agar/lắt [33], [34].
Môi trường tái sinh cây ựịa lan từ protocorm là MS + 2% saccarose + 15% nước dừa. Môi trường thắch hợp ựể tạo cây hoàn chỉnh là MS + 10g saccarose + 0,3ppm NAA (hoặc 1g than hoạt tắnh) + 6,5g agar/lắt [34].
Theo Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thanh Hằng, Nguyễn Thị Diệu Hương, đinh Văn Khiêm, Nguyễn Trắ Minh và Phan Xuân Huyên (phân viện sinh học tại đà Lạt) môi trường nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng ựể tạo PLB là môi trường 1/2 MS (Murashige và Skoog, 1962) hay môi trường KnudsonC. Môi trường nuôi cấy là môi trường MS có bổ sung chất kắch thắch sinh trưởng gồm 0,2 mg/l NAA; 2,0 mg/l BA và 15 % nước dừa là thắch hợp cho quá trình nhân nhanh PLB [44]
Qua các kỹ thuật cắt PLB thì cách cắt làm tư theo chiều gốc ngọn tạo PLB nhiều nhất [44].
Mơi trường có bổ sung 0,5 mg/l NAA thắch hợp cho việc tạo rễ in vitro cây ựịa lan [44].
Cây ựịa lan cấy mô sau khi xử lý thuốc nấm Zineb 0,2% trồng vào khay dớn, ánh sáng trực tiếp dưới 30% với chế ựộ tưới nước và phun dinh dưỡng qua lá thắch hợp có tỷ lệ sống của cây con ựạt 95% [44].
Cây con sau khi chuyển sang chậu lớn với giá thể là hỗn hợp 1/2 dớn sợi + 1/2 dớn cây, có phối trộn phân chuồng, ánh sáng trực tiếp 50%, phun thuốc bảo vệ thực vật theo ựịnh kỳ thì cây lan sinh trưởng và phát riển tốt [22], [44].