Thị kiểm tra độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab

Quá trình tách ly qua cột đƣợc nghiên cứu bao gồm tìm dung dịch rửa giải, tốc độ rửa giải và phân đoạn thu sản phẩm.

Quá trình chọn dung dịch rửa giải đƣợc thực hiện bằng cách sau khi gắn phóng xạ với kháng thể, hỗn hợp miễn dịch bao gồm phức hợp miễn dịch phóng xạ

131I-rituximab,131I tự do và các chất oxy hóa, chất khử cịn thừa trong hỗn hợp phản ứng, các thành phần đó đƣợc tách ra khỏi nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel. Thu sản phẩm qua cột theo từng phân đoạn 1 ml và đo hoạt độ phóng xạ. Việc chọn hệ đệm tách đƣợc thực hiện sao cho tách các thành phần ra khỏi sản phẩm, vừa không làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm, đó là dùng nƣớc muối sinh lý 0.9% và dùng đệm PBS 0,2M, pH 7,2. Cân bằng cột tách trong vài giờ, mặt gel phải luôn luôn ngập trong dung dịch. Trƣớc khi cho hỗn hợp dung dịch đã gắn vào cột, kiểm tra pH của dung dịch chảy qua cột và lƣợng dung dịch trên cột vừa sát mặt gel. Dùng pipet hút dung dịch đã gắn nạp vào cột gel, để lại khoảng 10 l để kiểm tra

dung dịch NaCl 0,9% hoặc đệm phosphat 0,02 M. Vận tốc xối 30 cm3/giờ. Hiệu suất gắn của 131I-rituximab đạt từ 94-97%. Đồ thị tách phân đoạn sản phẩm nhƣ hình 3.6.

Hình 3.7. Tách 131I-rituximab qua cột sephadex dùng dung dịch rửa giải là phosphat và nƣớc muối sinh lý 0,9%.

Chọn phân đoạn có hoạt độ phóng xạ chứa phức hợp 131I-rituximab, dồn lại, đo hoạt độ phóng xạ tổng, kiểm tra chất lƣợng, lọc qua phil lọc vô trùng 0,20m và bảo quản ngay ở nhiệt độ 2-40C. So sánh hai hệ dung dịch tách sản phẩm, đồ thị trong hình 3.11 cho thấy quá trình tách 131I-rituximab và 131I có thể dùng cả hai loại dung dịch rửa giải là dung dịch NaCl 0,9% và dung dịch đệm PBS pH 7,2. Việc thu sản phẩm khi dùng hai hệ đệm là giống nhau, miền thu nhận sản phẩm là 3-5 ml. Phân tử 131I tự do tách khỏi hỗn hợp và thu đƣợc trong khoảng 10-11 ml. Khi cho chất rửa giải là đệm phosphat hoặc dung dịch NaCl 0,9% đi qua cột, mẫu 131I- rituximab và 131I tự do đƣợc hòa tan trong pha động di chuyển, các cấu tử phân bố giữa hai pha, khi cho pha động đi qua cột, phần hòa tan của cấu tử 131I-rituximab chảy xuống dƣới và sự phân bố mới giữa pha động và pha tĩnh sẽ diễn ra. Thêm dung mơi rửa giải sẽ mang các phân tử hịa tan di chuyển xuống cột, bởi vì sự di chuyển của chất tan chỉ xảy ra trong pha động. Chất rửa giải thích hợp cho131I-

0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hoạt độ p hó ng x ạ (m C i)

Phân đoạn 131I - rituximab (ml)

Phosphat 0,2M, pH 7,2 NaCl 0,9%

rituximab là đệm phosphat 0,2M, pH 7,2 hoặc dung dịch NaCl 0,9%. Vì để sản phẩm thu đƣợc ổn định, dung dịch rửa giải dùng trong pha động có thể khơng thay đổi thành phần trong suốt quá trình rửa giải.

3.1.7.Kết quả đánh giá tínhổn định của phức hợp 131I-rituximab

Kết quả sau 22 ngày bảo quản, độ ổn định của phức hợp 131I-rituximab trong các lơ (n=3) đƣợc tóm tắt trong đồ thị (hình 3.8):Đồ thị trên hình 3.8A cho thấy rằng phức hợp miễn dịch phóng xạ 131I-rituximab sau khi tinh sạch và bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 80C bền theo thời gian [Richard L., 2005]. Sau 22 ngày bảo quản, dung dịch trong suốt khi quan sát bằng mắt và độ tinh khiết hóa phóng xạ đạt hơn 95% (Hình 3.9).

Hình 3.8. Đánh giá tính bền vững của 131I-rituximab

Hình 3.9 minh họa phức hợp sau khi điều chế:Độ tinh khiết hóa phóng xạ của

131I-rituximab sau khi điều chế đạt hơn 99%. Đồ thị trên hình 3.8B cho thấy sau khoảng thời gian 11 ngày, phức 131I-rituximab bắt đầu có sự phân hủy, 131I tự do trong mẫu tăng dần. Quan sát mẫu bảo quản thấy dung dịch 131I-rituximab có màu vàng nhạt, có lẽ do ảnh hƣởng của một lƣợng nhỏ chất oxy hóa, chất khử cịn tồn tại, phân tử kháng thể bị đứt gãy làm phân hủy tạo ra 131I tự do (Hình 3.10):

0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Độ tinh khí6t hóa phóng xạ (% )

Thời gian (ngày)

(A) 131I-rituximab sau khi tinh sạch (B) 131I-rituximab trƣớc khi tinh sạch

(A)

Hình 3.9. Độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab sau khi điều chế, TCC, autoradiography

Hình 3.10. Độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab sau khi bảo quản 22 ngày, TCC, autoradiography

Đồ thị 3.10cho thấy, phức kháng thể gắn đồng vị phóng xạ khơng cịn bền vững sau 22 ngày bảo quản, phần 131I tự do tạo thành hơn 50%. Việc theo dõi tính ổn định của phức sẽ cho thơng số bảo quản sản phẩm và tính hạn dùng cho thuốc. So sánh với các nghiên cứu đã công bố về việc bảo quản thuốc phóng xạ chứa kháng thể, nhiệt độ lạnh từ 20C và lạnh đóng băng là thích hợp cho q trình bảo quản. Kết quả nghiên cứu tƣơng tự nhƣ các nghiên cứu đã công bố[Richard L.,2005].Sau khi tinh sạch phức hợp bền hơn là do sản phẩm khơng cịn chứa những chất nhƣ chloramin T thừa, natrimetabisulphite thừa có thể gây hỏng kháng thể, hoặc iot-131 tự do làm giảm độ tinh khiết của phức hợp.

Tóm lại, việc nghiên cứu điều chế phức hợp miễn dịch phóng xạ 131I- rituximab đã thực hiện bằng những thí nghiệm khảo sát các điều kiện tối ƣu để gắn kháng thể đơn dịng rituximab với đồng vị phóng xạ 131I. Kết quả gắn kháng thể đơn dịng với đồng vị phóng xạ 131I cho thấy chất phóng xạ 131I gắn nhanh vào phân tử kháng thể bằng phƣơng pháp chloramin T, hiệu suất gắn cao, đạt khoảng 94 - 97%. Nồng độchloramin T tối ƣu để gắn 500 g kháng thể với 5 mCi 131I là 10g, thời gian phản ứng từ 3-5 phút, pH thích hợp là 7,5, hoạt độ riêng của 131I-rituximab là 6,6 mCi/mg và 2mCi/mg. Q trình gắn phóng xạ theo tỉ lệ mol giữa iod và kháng thể là phù hợp với tính tốn lý thuyết thống kê tốn học, trung bình có 1-2 nhóm nguyên tử 131I gắn trên một phân tử kháng thể. Số nhóm gắn này thích hợp để điều chế phức 131I-rituximab dùng trong chẩn đoán và điều trị [Kaminski MS, 2005]. Sự duy trì số nhóm gắn của ngun tử 131I trên phân tử kháng thể cho hiệu suất gắn phóng xạ với kháng thể ổn định và ổn định hoạt tính của kháng thể [Nikula TK, 1995] và [Lindmo T.,1984].

3.2.Kết quả kiểm tra chất lƣợng của 131I-rituximab

Các kết quả kiểm tra chất lƣợng của phức hợp 131I-rituximab gồmđộ tinh khiết hóa phóng xạ, độ tinh khiết hạt nhân phóng xạ, kiểm tra tính ổn định, thử vơ khuẩn, kiểm tra chí nhiệt tố đƣợc tổng hợp trong các nội dung sau:

3.2.1.Kết quả kiểm tra độ tinh khiết hoá phóng xạ của 131I-rituximab

Kết quả kiểm tra độ tinh khiết hóa phóng xạ của phức hợp 131I-rituximab đƣợc thực hiện và so sánh bằng phƣơng pháp điện di, hình 3.11:

Hình 3.11. Đồ thị phân tích độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab, điện di, 60 phút, kích thƣớc băng điện di 20 x 200mm, Bioscan.

Phƣơng pháp điện di đƣợc sử dụng từ lâu trong phân tích các dƣợc chất phóng xạ gắn kháng thể. Phƣơng pháp này cho kết quả chính xác trong phân tích đặc biệt là với các protein nhƣ kháng thể và chất phóng xạ nhƣ 131I. Kết quả phân tích là 99,49 ± 0,21%.

Khi dung dịch các chất đƣợc đặt trong điện trƣờng, các chất phân ly thành ion hay có khả năng tạo các tiểu phân tĩnh điện sẽ dịch chuyển về phía điện cực trái dấu với nó. Các chất trong hỗn hợp tách biệt nhau rõ ràng, iod-131 tự do di chuyển từ điện cực âm sang dƣơng, kháng thể là đại phân tử mang điện tích, đƣợc phân giải trên cơ sở sự di chuyển của chúng trong trƣờng điện, phức hợp 131I-rituximab nằm tại vị trí gốc Rf = 0,1-0,2. Hình 3.12. Phƣơng pháp này ít tốn kém, nhƣng cần thời gian lâu, khoảng 60 phút cho một lần sắc ký, dung môi sử dụng nhiều. Kết quả phân tích là 99,34 ± 0,15 %.