Sản phẩm, chỉ tiêu Chất lƣợng Phƣơng pháp
Dung dịch 131I-rituximab, trong nƣớc muối sinh lý
5 mCi/10ml Dung dịch trong suốt,
không màu
Chloramin T
Hoạt độ riêng 6,6 Ci/g và
2,0 Ci/g
Tính bằng hoạt độ phóng xạ và nồng độrituximab
pH 6 - 7 Theo DĐVN IV, Phụ lục 6.2
Hiệu suất gắn > 95,0% Sắc ký lọc gel, TLC, TCC,
điện di Độ tinh khiết hóa phóng xạ > 98,0%
TCCS-DPPX 13-2010
FPLC, sắc ký lớp mỏng TLC, sắc ký giấy, TCC điện di Độ tinh khiết hạt nhân
phóng xạ > 99,9%
TCCS-DPPX 14-2010
Đo phổ gamma bằng phổ kế gamma ORTEC® DSPEC jrTM Độ ổn định trong huyết
thanh > 95,0% Sắc ký lớp mỏng TLC
Bảo quản -200C và 40C sau
17 ngày > 95,0% Sắc ký điện di
Độ vô khuẩn Đạt
TCCS-DPPX 16-2010 Lọc vô trùng qua phin lọc milipore 0,20 m
Nội độc tố vi khuẩn
< 3 EU/ml
DĐVN IV. Phụ lục 13.2 TCCS-DPPX 15-2010
Pha loãng mẫu 1:40 lần (máy PTS 100)
3.2.5.Kết quả gắn tế bào với phức hợp 131I-rituximab
Kết quả nuôi cấy, thu hoạch tế bào ung thư Raji và nguyên bào sợi: Sau khi tế bào Raji tăng sinh và thu hoạch đủ số lƣợng, loại bỏ môi trƣờng nuôi cấy và chuyển vào chai nuôi tế bào trong mơi trƣờng có bổ sung 10% DMSO.Tế bào đƣợc thu hoạch, ly tâm rửa sạch môi trƣờng, chuyển tế bào trong đệm PBS để làm thí nghệm gắn với phức hợp, nồng độ tế bào là 107tếbào/ml. Tế bào nguyên bào sợi sau 5 ngày ni, khi thu hoạch có nồng độ 3 x 105 tế bào/ml. Tế bào Raji là dòng tế bào ung thƣngƣời đầu tiêncó nguồn gốc từ tế bào tạo huyết.Tế bào Raji có mật độ CD20
cao trên bề mặt tế bào, đƣợc sử dụng trong nghiên cứu gắn với phức hợp 131I- rituximab.Nguyên bào sợi là một loại tế bào quan trọng chứa trong các mơ liên kết, có chức năng tiết các protein là thành phần của các sợi ngoại bào. Khi mơ liên kết bị tổn hại, ngun bào sợi có thể nhanh chóng tăng trƣởng, tiết chất nền collagen và biệt hóa thành các tế bào khác để hồi phục vết thƣơng. Nhờ những đặc tính trên, nguyên bào sợi rất dễ nuôi cấy và đƣợc ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và y học nhƣ để thu nhận tế bào mầm, nghiên cứu di truyền, trị bỏng. Riêng trong các nghiên cứu in vitro, nguyên bào sợi có thể tồn tại lâu dài và duy trì cấu trúc lƣỡng bội nhiễm sắc thể. Trong thí nghiệm này, tế bào nguyên bào sợi đƣợc dùng với mục đích so sánh khả năng gắn của phức hợp 131I-rituximab với tế bào ngƣời bình thƣờng với tế bào ngƣời ung thƣ Raji (Hình 3.22).
Tế bào Raji mới gieo, chụp trên kính hiển vi soi ngược Primo Vert (độ phóng đại x 400)
Tế bào Raji tăng sinh, chụp trên kính hiển vi soi ngược Primo Vert
(độ phóng đại x 400)
Nguyên bào sợi mới gieo, chụp trên kính hiển vi soi ngược Primo Vert
(độ phóng đại x 400)
Tế bào Raji khi thu hoạch chụp trên kính hiển vi soi ngược Primo Vert (độ phóng đại x 400)
Tế bào Raji chụp trên kính hiển vi Nikon 80i (độ phóng đại x 1000)
Nguyên bào sợi khi thu hoạch, chụp trên kính hiển vi soi ngược Primo Vert
Kết quả kiểm tra hoạt tính miễn dịch của 131I-rituximab gắn với tế bào ung thư Raji:Đồ thị kiểm tra hoạt tính đặc hiệu và phần gắn không đặc hiệu của 131I- rituximabvới tế bào Raji đƣợc biểu diễn trên hình 3.23. Trên đồ thị, trục tung là phức gắn đặc hiệu của 131I-rituximab với tế bào, trục hoành là nồng độ tế bào tăng dần. Kết quả cho thấy khả năng phức hợp gắn với tế bào đạt hơn 54%. Phần gắn khơng đặc hiệu ít hơn 3%. Phƣơng pháp Lindmo đƣa ra kỹ thuật chuẩn để tính hoạt tính miễn dịch của kháng thể sau khi gắn phóng xạ, theo phƣơng pháp này kết quả phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ nồng độ kháng thể, thời gian ủ, hoạt tính riêng, ví dụ thời gian ủ càng lâu, phức gắn càng giảm và NSB cao, hoạt tính riêng càng cao phức gắn càng thấp. Thực nghiệm đã chọn các thơng số hợp lý để có kết quả phức gắn đạt giá trị tối ƣu nhƣ thời gian ủ 120 phút, hoạt độ riêng 9,3 Ci/g.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 R a j i c e l l s c o n c e n t r a t i o n ( m i l l i o n / m l ) B o u n d /T o ta l S p e c i f i c b i n d i n g N o n s p e c i f i c b i n d i n g
Hình 3.23.Đồ thị kiểm tra hoạt tính miễn dịch của 131I-rituximab
Kết quả gắn bão hòa của 131I-rituximab với tế bào ung thƣ Raji và kết quả tính hằng số Kd và Bmax đƣợc trình bày trong Hình 3.24. Trục hồnh là nồng độ tăng dần của 131I-rituximab, phần gắn đặc hiệu amol/cell đƣợc vẽ trên trục tung là số vị trí gắn của kháng thể trên mỗi tế bào. Kết quả đƣợc phân tích bởi phƣơng pháp làm khớp với hàm phi tuyến (nonlinear regression) dùng phần mềm Graphpad Prism 7.
Hình 3.24.Đồ thị gắn bão hòa 131I-rituximab với tế bào ung thƣ Raji
Phần gắn khơng đặc hiệu NSB đƣợc tính bởi sự cạnh tranh với 500 g kháng thể rituximab khơng phóng xạ. Phƣơng pháp đƣợc cải biến bởi Konishi dựa trên thí nghiệm của Lindmo mà khơng cần ngoại suy để tính hoạt tính miễn dịch của kháng thể đã gắn phóng xạ. Đồ thị đạt đến giá trị cực đại cho thấy bão hòa. Giá trị Kd là 6,2 nmol/L, Bmax là 1,24 amol/tế bào và từ đó số vị trí gắn của kháng thể trên tế bào là 7 x 105. Phần gắn khơng đặc hiệu ít hơn 3%, phần gắn với nguyên bào sợi nhỏ hơn 15%. Các tế bào nguyên bào sợi là tế bào không mang dấu ấn CD20, do vậy khả năng gắn với tế bào lành của phức hợp là ít xảy ra, tỉ lệ này một phần nói lên có phản ứng chéo khơng đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên khác trên bề mặt tế bào tuy không đáng kể. Các kết quả cho thấy ái lực của kháng thể sau khi gắn phóng xạ đối đảm bảo hoạt tính miễn dịch và số vị trí gắn trên mỗi tế bào đạt 105 phù hợp khi so sánh với trong các nghiên cứu đã công bố [88-89].
Kết quả gắn phức hợp 131I-rituximab với tế bào bạch cầu bệnh nhân NHL:
15 mẫu máu bệnh nhân đƣợc chẩn đoán là NHL, tế bào B, CD 20 dƣơng tính đƣợc lấy, bảo quản và tách tế bào bạch cầu lympho bằng ficoll. Kết quả thu đƣợc sau khi tách và đếm bằng máy đếm huyết học 18 thông số cho thấy 15 mẫu đều đạt đƣợc số lƣợng bạch cầu lympho cần thiết để tiến hành cho nghiên cứu thực nghiệm gắn 131I- rituximab với bạch cầu lympho máu bệnh nhân (Hình 3.25).
Hình ảnh tế bào bạch cầu lympho ở máu ngoại vi và trên mô bệnh học, hóa mơ miễn dịch ở bệnh nhân ULAKH, nguồn: BV Bạch Mai.
Hình ảnh tế bào bạch cầu lympho ở máu ngoại vi và trên mơ bệnh học, hóa mơ miễn dịch ở bệnh nhân ULAKH, nguồn: BV Bạch Mai.
Mô bệnh học của bệnh nhân NHL trên sinh thiết hạch
Hình ảnh nhuộm hóa mơ miễndịch dấu ấn CD20 dương tính ở bệnh nhân NHL
Hình 3.25.Hình ảnh tế bào bạch cầu lympho ở máu ngoại vi và trên mô bệnh học,
Kết quả tách tế bào bạch cầu từ mẫu máu bệnh nhân, bảng 3.11:
Bảng 3.11.Kết quả thu tế bào bạch cầu từ các mẫu máu bệnh nhân NHL, CD20(+)
Tên mẫu Tế bào thu đƣợc (x 106)/ml
Thể tích mẫu (ml)
Tên mẫu Tế bào thu đƣợc (x 106)/ml Thể tích mẫu (ml) M1 3,2 1 M9 0,8 2 M2 6,9 1 M10 0,7 2 M3 1,6 1 M11 1,4 4 M4 2,9 1 M12 1,3 4 M5 1,6 1 M13 3,1 4 M6 3,5 1 M14 3,2 4 M7 1,2 1 M15 3,6 4 M8 1,8 2
Kết quả gắn của 131I-rituximabvới tế bào bạch cầu có mang CD20 dƣơng tính, tách từ máu ngoại vi bệnh nhân NHL (Bảng 3.12):
Bảng 3.12.Tỷ lệ gắn của 131I-rituximab gắn với CD20 trên bạch cầu máu ngoại vi bệnh nhân NHL Mẫu Với nồng độ tế bào 106 Tỷ lệ gắn (%) M1 9,59 M2 8.80 M3 13,44 M4 11,10 M5 14,39 M6 24,18 M7 26,29 M8 19,83 M9 34,15 M10 20,91 M11 25,28 M12 34,48 M13 25,19 M14 36,74 M15 33,17 Trung bình ± SD 22,5 ± 9,52
Vì đặc điểm bệnh NHL là bệnh lý ung thƣ của tế bào lympho trong cơ thể, chủ yếu bệnh biểu hiện tại hạch, cơ quan bạch huyết. Tế bào ung thƣ có thể lƣu thơng theo đƣờng bạch huyết đi vào máu ngoại vi và lƣu thơng trong tuần hồn. Tùy thuộc vào giai đoạn bệnh, mức độ lan tràn tiến triển của bệnh mà số lƣợng tế bào này ngồi máu ngoại vi nhiều hay ít. Trong nghiên cứu của chúng tơi vì cỡ mẫu là 15 bệnh nhân nên chƣa khảo sát đƣợc tỷ lệ gắn theo giai đoạn bệnh và theo độ mô bệnh học. Tế bào lympho mang dấu ấn CD20 ở máu ngoại vi có thể là tế bào lympho bình thƣờng hoặc là tế bào của NHL và chúng đều có thể gắn với kháng thể
131I-rituximab.
Kết quả kiểm tra hoạt tính miễn dịch của phức hợp 131I-rituximabvới kháng nguyên CD20: Kỹ thuật gắn kháng nguyên CD20 lên cột sắc ký đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp gắn đặc hiệu đuôi His-tag của kháng nguyên CD20 lên cột niken NTA agarose. Sau khi gắn kháng nguyên CD20 lên cột, phức kháng thể 131I- rituximab đƣợc ủ với kháng nguyên CD20 trên cột, sau đó tách phần gắn không đặc hiệu và phần tự do ra đo hoạt độ phóng xạ và tính tốn phần trăm hoạt tính gắn.Đồ thị biểu diễn kết quả gắn của 131I-rituximab với kháng nguyên CD20 lên cột niken agarose (Hình 3.26).
Hình 3.26.Hoạt tính gắn của 131I-rituximab với kháng nguyên CD20 90 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 10 20 30 50 100 1000 5000 10000 Ph ức 131I -rituxim ab gắn CD20 (%) Hàm lƣợng kháng nguyên CD20 (ng)
Phản ứng gắn phức hợp 131I-rituximab lên kháng nguyên CD20 cho kết quả hoạt tính gắn đạt hơn 97% trong miền từ 50ng đến 10g. Số liệu cho thấy kháng thể đơn dịng rituximab khi gắn với đồng vị phóng xạ 131I khơng bị mất hoạt tính. Biểu đồ cịn cho thấy khả năng gắn cực đại của kháng thể gắn phóng xạ với kháng nguyên CD20 đạt đến 98%. Số liệu cho thấy hoạt tinh miễn dịch của phức hợp đảm bảo cho sử dụng trong điều trị.
Phân tử kháng nguyên CD20 đƣợc gắn kết với 6 histidine vào dƣới đuôi của mạch N- hoặc C- cuối của phân tử. Để giải thích cơ chế gắn ta biết rằng, hạt niken NTA agarose bao gồm mạng agarose điều chế dẫn xuất với nitroacetic axit và nạp ion niken hóa trị II trên mạng liên kết, hình 3.27 minh họa cho liên kết niken và histindine trên phân tử CD20:
Hình 3.27.Kháng nguyên CD20-histaggắn lên hạt agarose trên cột sắc ký
Kháng nguyên CD20 gắn lên cột sepharose rất bền vững bằng liên kết hóa học, ion niken có 6 electron liên kết cộng hóa trị phối trí, độ bền của phức giống nhƣ liên kết cộng hóa trị. NTA gắn với 4 trong 6 liên kết này, 2 liên kết còn lại là vị trí gắn dành cho liên kết phối trí với protein có đi histag. Phân tử NTA là tác nhân tạo phức, là phối tử có khả năng gắn 4 nhóm chức với ion kim loại. NTA gồm
có 4 vị trí tetraadentate trong đó bị chiếm giữ 4 trong 6 vị trí gắn trên mặt cầu của ion niken. Hai vị trí khác tƣơng tác với histidine của phân tử CD20.Ƣu điểm phƣơng pháp sắc ký này là nhanh, dễ sử dụng, các sản phẩm đuôi histag đƣợc chứng minh bằng thực nghiệm, độ nhạy ở mức picogram. Protein gắn với hạt nhựa có thể giải hấp bằng đệm pH thấp hoặc cánh tranh với imidazol hoặc histidine.
3.2.6. Kết quả đánh giá phân bố, đào thải và an toàn của 131I-rituximabtrên động vật thực nghiệm
Kết quả kiểm tra phân bố sinh học 131I-rituximab trên chuột: Kết quả kiểm
tra phân bố thuốc 131I-rituximab liều tiêm 100Ci/100l mỗi con chuột theo các khoảng thời gian 1, 4, 16, 48, 72, 120, 168 giờ đƣợc tóm tắt nhƣ bảng 3.13.