3.1.1. Kết quả khảo sát nồng độchloramin T tham gia trong phản ứng tạo phức hợp 131I-rituximab hợp 131I-rituximab
Trong q trình khảo sát nồng độchất oxy hóa, trong các ống phản ứng gắn kháng thể với đồng vị phóng xạ, sử dụng nồng độkháng thể rituximab là 500g/ml, hoạt độ phóng xạ 131I là 5mCi và pH giống nhau, sự thay đổi nồng độchloramin T trong phản ứng đã tạo ra hiệu suất gắn khác nhau. Kết quả khảo sát nồng độchất oxy hóa chloramin T tham gia phản ứng tạo phức hợp miễn dịch phóng xạ 131I- rituximab đƣợc trình bày trong hình 3.1:
Hình 3.1.Khảo sát hiệu suất gắn theo nồng độ chloramin T
Trục hoành của đồ thị là nồng độchloramin T, trục tung là hiệu suất gắn . Đồ thị cho thấy với với nồng độchloramin T trong miền từ 1-10g, hiệu suất gắn đạt hơn 90% và với nồng độchloramin T trong khoảng 10g và 20g, hiệu suất gắn hơn 97%.
Trên phân tử kháng thể tồn tại rất nhiều các axit amin có cấu trúc vịng phenol nhƣ tyroxin, histidin, tryptophan hoặc nhóm sulphydryl, do vậy I+ sau khi tạo thành rất dễ thay thế vào vòng thơm, tạo thành phức hợp bền vững. Chloramin T là chất oxy hóa nhẹ, trong nƣớc dễ tạo thành acid hypochlorous HClO, acid
85 90 95 100 105 0 10 20 30 40 50 60 Hiệu suất gắn (%) Chloramin T (g)
hypochlorous là chất oxy hóa thực hiện phản ứng chuyển I- thành I+[01, 02, 85]theo phản ứng hóa học:
HClO + Na131I HO131I + NaCl
I+ là chất oxy hóa mạnh, phản ứng thuận và nhanh tại pH trung tính, I+ thay vào vị trí ortho của hydro trên vòng phenol. Trong môi trƣờng pH 7,5 của PBS 0,5M, ion 131I+ tiến hành phản ứng thế electrophin, gắn vào vị trí ortho trên vịng benzen, phản ứng tạo phức hợp 131I-rituximab:
Cơ chế phản ứng là phản ứngthế electrophin, trên vịng benzen có nhóm đẩy điện tử OH-, gây ra hiệu ứng cộng hƣởng dƣơng, do đó tại vị trí ortho, mật độ electron cao, vì vậy 131I+ tấn cơng vào vị trí này hình thành liên kết cộng hóa trị.
Q trình dừng phản ứng đƣợc giải thích là do lƣợng chloramin dƣ sẽ ảnh hƣởng đến hoạt tính của kháng thể, nên chất khử Na2S2O5đƣợc sử dụng trong phản ứng để trung hịa lƣợng chất oxi hóa cịn lại:
S2O52- + 4OH- +2H+ + 2ClO- 2SO4 2- + 3H2O +2Cl-
Khi phản ứng dừng, các chất oxy hóa, chất khử cịn thừa đƣợc tinh sạch ra khỏi phức hợp miễn dịch phóng xạ bằng phƣơng pháp lọc gel. Vì vậy chọn nồng độchloramin T sao cho lƣợng cần thiết là tối thiểu đủ để phản ứng xảy ra và hiệu suất gắn đạt nhƣ mong muốn. Chloramin T đƣợc chọn trong phản ứng gắn điều chế 131I- rituximab là 10g để oxy hóa 5mCi và 500g kháng thể với hiệu suất gắn trong khoảng 97,3 ± 0,9%. So sánh với một số tác giả nhƣ Andreas và cộng sự [Andreas O. Schaffland, 2004], nồng độ chloramin T đã đƣợc dùng là 50gđể oxy hóa 185- 370MBq 131I, chất oxy hóa đã đƣa ra là hồn tồn phù hợp và an tồn vì khơng làm mất hoạt tính kháng thể. Lƣợng thừa iodine và chloramin T trong phản ứng gắn có
thể loại bớt qua cột lọcgel hoặc lọc trao đồi ion nhƣ các tài liệu đã công bố [Gopal B. Saha, 2012]để bảo tồn hoạt tính kháng thể [Jones PT, 1986], [Kassis, A.I. 2005].
3.1.2.Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo phức hợp 131I-rituximab
Thời gian phản ứng gắn kháng thể với đồng vị phóng xạ đƣợc khảo sát Bảng 3.1:Khảo sát hiệu suất gắn theo thời gian phản ứng, TLC trong methanol: NaCl (85:15), n=6
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hiệu suất đánh dấu theothời gian
Thời gian phản ứng (phút) 1 5 10 20 30 Hiệu suất gắn (%) 98,9 ± 0,5 99,3 ± 0,3 96,8 ± 0,4 96,7 ± 0,2 94,3 ± 0,4 Kết quả cho thấy, thời gian tối ƣu để phản ứng đạt hiệu suất cao là khoảng 3- 10 phút, thời gian ít hơn có thể khơng đủ cho phản ứng xảy ra hoàn toàn, thời gian lâu hơn (>10 phút) phản ứng có hiệu suất gắn giảm đi, có thể do phân tử chất oxy hóa làm thay đổi nhẹ hoạt tính của kháng thể hoặc làm hỏng một số cấu trúc của kháng thể. Hình 3.2 là hiệu suất gắn điều chế phức hợp 131I-rituximab:
Số đếm
Chiều dài giấy (mm)
Hình 3.2.Hiệu suất gắn điều chế phức hợp 131I-rituximab, TLC, Bioscan
R e g io n 1 B k g 1 B k g 2 R e g io n 2 0 . 0 5 0 . 0 1 0 0 . 01 5 0 . 20 0m 0 .m 0 0 . 0 1 0 0 . 0 2 0 0 . 0 3 0 0 . 0 4 0 0 . 0 5 0 0 . 0 6 0 0 . 0 7 0 0 . 0 8 0 0 . 0 9 0 0 . 0 1 0 0 0 . 0 C o u n t s
Phản ứng oxy hóa thƣờng xảy ra nhanh, khi mà các phân tử vừa tiếp xúc nhau, có thể chỉ sau một vài phút, hơn 90% phức hợp kháng thể gắn đồng vị phóng xạ đƣợc tạo thành, khi đó một nguyên tử iod phóng xạ 131I đƣợc gắn vào vịng phenol tại vị trí 3’ đồng thời cũng có một số ít ngun tử 131I gắn vào cả vị trí 5’ trên vịng phenol tùy thuộc vào thời gian phản ứng. Do vậy chọn thời gian phản ứng tối ƣu cho phản ứng gắn kháng thể là cần thiết. Kết quả cho thấy, để ít ảnh hƣởng đến việc có nhiều 131I gắn lên một kháng thể, thời gian hợp lý đƣợc chọn là 5 phút.
3.1.3.Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể sử dụng điều chế 131I-rituximab
Nồng độ kháng thể đƣợc khảo sát là 0,1g, 1g, 10g, 100g và 1000g, hoạt độ phóng xạ tại mỗi điểm khảo sát là 2 mCi 131I và pH là 7,5 thời gian gắn 1, 5, 10, 20, 30 phút, hình 3.3:
Hình 3.3.Khảo sát hiệu suất gắn theo nồng độ kháng thể,
TLC trong methanol: NaCl (85:15), n=6
Hình 3.3 cho thấy trong khoảng 0,1 - 1g/ml kháng thể, hiệu suất gắn chỉ đạt 10 - 30%, có thể trong miền này 131I tự do còn thừa, tất cả số phân tử kháng thể đều đƣợc gắn. Với khoảng 10g/ml kháng thể, hiệu suất gắn đạt khoảng 60 - 80%. Hiệu suất gắn của kháng thể với đồng vị phóng xạ 131I đạt từ 80 đến 98% khi nồng độ kháng thể trong phản ứng từ 100 -1000 g/ml. 0 20 40 60 80 100 0.1 1 10 100 1000 Hiệu suất gắn (%) Nồng độ kháng thể (g/ml)
Chọn thời gian phản ứng là 5 phút để tính tỷ lệ mol I/Mab và số nguyên tử
131I gắn trên phân tử kháng thể. để tính tỉ lệ mol giữa hoạt độ phóng xạ 2mCi (74MBq) và nồng độkháng thể 0,1, 1, 10, 100 và 1000g/ml (tƣơng đƣơng 6,9 x 10-4 nmol, 6,9 10-3 nmol, 0,069 nmol, 0,69 nmol và 6,9 nmol). Áp dụng công thức tính tỉ lệ mol để tính số iod trên phân tử kháng thể. Khối lƣợng của 131I trong 2 mCi (74 MBq) dùng để gắn phóng xạ là:
74 ×103
222 = 333,3 (ng)
Số mol của I trong dung dịch là 333,3
127 = 2,624 nmol.
Nồng độ mol kháng thể là 6,9 x 10-4 nmol (0,1 g), khi đó tỉ lệ mol của iod và kháng thể dùng trong phản ứng gắn là:
𝐼
𝑀𝑎𝑏= 2,624
6,9 ×10−4 = 3,802 × 103
Nồng độ mol kháng thể là 6,9 x 10-3 nmol (1,0 g), khi đó tỉ lệ mol của iod và kháng thể dùng trong phản ứng gắn là:
𝐼
𝑀𝑎𝑏= 2,624
6,9 ×10−3 = 3,802 × 102
Nồng độ mol kháng thể là 6,9 x 10-2 nmol (10,0 g), khi đó tỉ lệ mol của iod và kháng thể dùng trong phản ứng gắn là:
𝐼
𝑀𝑎𝑏= 6,9 ×10 2,624−2 = 38,028
Nồng độ mol kháng thể là 0,69 nmol (100,0 g), khi đó tỉ lệ mol của iod và kháng thể dùng trong phản ứng gắn là:
𝐼
𝑀𝑎𝑏= 2,624
0,69 = 3,802
Nồng độ mol kháng thể là 6,6 nmol (1000,0 g), khi đó tỉ lệ mol của iod và kháng thể dùng trong phản ứng gắn là:
𝐼
𝑀𝑎𝑏= 2,624
Bảng 3.2. Bảng số liệu hiệu suất gắn và tỉ lệ mol Nồng độkháng thể Nồng độkháng thể (g) Hiệu suất gắn của kháng thể với 131I (%) Tỉ lệ mol của I/kháng thể (I/Mab) Số nhóm nguyên tử I/Mab 0,1 6,2 3802 235 1,0 25,3 380,2 96 10,0 82,5 38,02 31 100,0 98,5 3,802 3,7 1000,0 99,7 0,380 0,4
Bảng số liệu cho thấy tỉ lệ mol quá cao giữa I và kháng thể cho hiệu suất gắn kém (lƣợng kháng thể quá ít). Điều này giải thích là một phần do 131I cịn thừa một phần do q trình xạ phân vì quá nhiều 131I trên phân tử kháng thể. Nồng độkháng thể cao thì số nhóm gắn trên phân tử kháng thể càng giảm. Dựa trên kết quả ta có thể chọn tỉ lệ mol thích hợp để điều chế phức 131I-rituximab dùng trong chẩn đoán và điều trị. Sự thiếu hụt kháng thể làm tăng 131I gắn trên lƣợng giới hạn kháng thể, cho hiệu suất gắn phóng xạ với kháng thể ít đi rõ rệt. Trong phản ứng, kháng thể từ 100 đến 1000 g, số nhóm gắn trên phân tử từ 3,7 đến 0,4 cho hiệu suất gắn cao (>98%). Các tác giả khi nghiên cứu điều trị lâm sàng, nồng độkháng thể sử dụng là 1mg và hoạt độ phóng xạ của 131I từ 0,83 - 8,8mCi. Hãng Bexxar đóng gói thƣơng mại với hai liều là 0,1 mg kháng thể và 0,6 mCi 131I và 1,1 mg kháng thể và 5,6 mCi 131I (sản phẩm đƣợc FDA cấp phép). Kết quả trên cho thấy nghiên cứu đã sử dụng hợp lý nồng độkháng thể để điều chế phức hợp 131I-rituximab cho lâm sàng [Kaminski, M. S.,2001], [MRC Laboratory of Molecular Biology, 2016], [Peter M. 2000].
3.1.4.Kết quả khảo sát pH phản ứng tạo phức 131I-rituximab
Ảnh hƣởng pH lên hiệu suất gắn kháng thể với đồng vị phóng xạ 131I đã đƣợc thực hiệnsử dụngnồng độkháng thể là 500 g/ml, hoạt độ đồng vị phóng xạ
131I là 5 mCi, nồng độchloramin T là 20 g/ml, thời gian phản ứng thay 5 phút ở nhiệt độ phịng. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.2 sau đây:
Bảng 3.3.Hiệu suất gắn phóng xạ theo pH, (n=3)
Kết quả khảo sát cho thầy quá trình gắn kháng thể rituximab với 131I đạt hiệu suất cao trong miền pH từ pH 7 đến pH 8. Có thể giải thích kết quả là trong miền pH từ 7 đến 8, sự oxy hóa của 131I- tạo thành 131I+ dễ dàng, phản ứng gắn 131I vào phân tử kháng thể hiệu quả hơn, cấu trúc gắn đơn và đa 131I trên vòng phenol của kháng thể nhƣ sau:
HO CH2 C COOH CH2 C
Trong miền pH nhỏ hơn 6 hiệu suất gắn thấp hơn có thể là do sự phân ly của HOCl trong mơi trƣờng axit. Tại pH 9 hiệu suất gắn của kháng thể đạt 85%. Nếu pH lớn hơn 9, phức hợp kháng thể gắn phóng xạ khơng bảo quản đƣợc trong mơi trƣờng kiềm và có sự thay thế của nhóm khác vào vị trí gắn của Iot hoặc phản ứng trở nên mất hiệu quả vì có sự tạo thành IO3- theo phản ứng sau:
I2 + OH- IO3- + I + H2O
Sự tạo thành iodate sẽ là tác nhân oxy hóa I- thành I+ và sau đó I lại bị khử ngay lập tức và tạo thành iodide do sự có mặt của bisulfite:
IO3− + 5 I− + 6 H+ → 3 I2 + 3 H2O
I2 + HSO3− + H2O → 2 I− + HSO4− + 2 H+
pH Hiệu suất gắn (%) 5 65,0 ± 1,1 6 89,2 ± 0,7 7 97,1 ± 0,8 7,5 97,2 ± 0,4 8 98,5 ± 0,7 9 85,0 ± 0,5 NH2 H I I NH2 H I COOH HO
Quá trình này làm ảnh hƣởng đến hiệu suất gắn của 131I vào phân tử kháng thể. Hơn nữa phức hợp kháng thể gắn phóng xạ khơng bảo quản đƣợc trong mơi trƣờng kiềm, Vì vậy q trình gắn tạo phức hợp và bảo quản phức hợp kháng thể đƣợc chọn trong miền pH trung tính [Gopal B. Saha, 2012].
Hầu hết các phản ứng gắn phóng xạ và bảo quản dƣợc chất phóng xạ đều thực hiện tại pH trung tính, trừ một số phản ứng đặc biệt nhƣ gắn DMSA với Tc- 99m tại pH = 3, DTPA gắn với Tc-99m tại pH = 5, gắn Y-90 với các peptid và kháng thể tại pH = 6. pH trung tính đƣợc chọn vì khơng làm mất hoạt tính kháng thể [Daniel S. 1993], [Pescovitz M. D., 2006].
3.1.5.Kết quả điều chế phức hợp 131I-rituximab theo hoạt độ riêng
Hoạt độ riêng của 131I-rituximab là hoạt tính phóng xạ của 131I trên đơn vị khối lƣợng của kháng thể đơn dòng rituximab dùng trong đánh dấu. Để điều chế phức hợp có hoạt độ riêng 6,6Ci/g 131I-rituximab, đánh dấu 30mCi 131I với 4,5mg kháng thể rituximab. Q trình iod hóa kháng thể theo hoạt độ riêng đƣợc tính nhƣ sau: Tỉ lệ mol trung bình giữa nguyên tử iod và phân tử kháng thể dựa trên hoạt độ riêng của iod là 222 GBq/mg (theo nhà sản xuất) và trọng lƣợng phân tử của kháng thể rituximab. Trọng lƣợng phân tử của rituximab là 143.890 Dalton (1mg rituximab tƣơng đƣơng 6,9 nmol). Phức hợp 131I-rituximabgắn với 30mCi 131I (1110 MBq), tƣơng đƣơng 39,37 nmol. Rituximab sử dụng là 4500 g tƣơng đƣơng 31,29 nmol. Tỉ lệ mol của Iot và kháng thể là 1,25. Hiệu suất gắn đạt 97% (hình 3.5), do vậy tỉ lệ mol I/mab trong chất phức hợp là 1,22. Để tạo phức hợp có hoạt độ riêng 2,0Ci/g đánh dấu 20mCi 131
I với 10,0mg kháng thể rituximab, cách tính tƣơng tự, ta có tỉ lệ mol I/mab trong chất phức hợp là 0,364. Các giá trị thích hợp cho nghiên cứu động học và nghiên cứu điều trị (vài 131I trên phân tử kháng thể và một 131I trên phân tử kháng thể) [Gopal B. Saha, 2012], [Azuwuike Owunwanne, 1995], [Andreas O. Schaffland, 2004], [Lindmo T., 1984].
Hình 3.4. Hiệu suất gắn kháng thể rituximab với 131I, TCC
Hoạt độ riêng thích hợp của 131I-rituximabđƣợc chọn đó là 6,6Ci/g và 2,0Ci/g (0,244 GBq/mg và 0,074 GBq/mg) dùng trong nghiên cứu chẩn đoán và điều trị. Trong các giá trị này số phân tử 131I gắn trên kháng thể đạt từ 0,3 đến 2 nhóm I trên mỗi phân tử kháng thể, tỉ lệ này không ảnh hƣởng đến sự xạ phân do bức xạ của phân tử kháng thể, nếu có nhiều số nguyên tử 131I gắn trên kháng thể sẽ có sự xạ phân xảy ra, làm đứt gãy phân tử và tạo thành các dạng không tinh khiết trong dung dịch. Các phức hợp sau khi gắn đƣợc tinh lọc qua cột lọc gel, đồ thị tách sản phẩm trong phức miễn dịch nhƣ hình 3.5. Sản phẩm thu đƣợc đạt yêu cầu các chỉ tiêu chất lƣợng của dƣợc chất phóng xạ nhƣ độ tinh khiết hóa phóng xạ, nồng độ phóng xạ, pH, tính ổn định, vô trùng và không chứa nội độc tố vi khuẩn.
Phân bố thống kê của iod đƣợc tính tốn theo phƣơng trình (1): Pi(x) = m/x! * e-m (1). Trong đó Pi(X) là xác suất của x nguyên tử iod gắn trên phân tử kháng thể, M là số trung bình của iod trên phân tử kháng thể. X là số nguyên tử iod. Vì khơng có chất mang, 131I chỉ gồm một phần nhỏ của 131I còn lại hầu hết là 127I bền[Andreas O. Schaffland, 2004]. Với hoạt độ riêng của 131I là 222 GBq/mg, thành phần phần trăm của 131I và 127I là 0,0455 và 0,9545.
Hình 3.5. Tách sản phẩm theo các hoạt độ riêng
Vì hoạt tính miễn dịch chỉ đo đƣợc trên những phân tử kháng thể đã gắn phóng xạ, nên xác suất kháng thể gắn đơn hoặc đa iod (mono hoặc poly iod) đƣợc tính tốn theo lý thuyết cơ bản nhƣ sau. Phân bố xác suất của 131I (phần A) và 127I (phần B) đối với số iod (x) trên mỗi phân tử kháng thể có thể viết là (a + b)x (nhị thức newton). Nếu 2 iod gắn trên phân tử kháng thể thì cơng thức sẽ viết là a2 + 2ab + b2, khi đó a2 + 2ab là xác suất kháng thể sẽ gắn với 1 nguyên tử iod 131I (2ab) hoặc 2 nguyên tử iod 131I (a2), và b2 là xác suất mà kháng thể chỉ iod hố với 127I. Khi đó xác suất gắn phóng xạ của Pa(x) cho thấy số iod trên mỗi phân tử kháng thể đƣợc tính tốn dùng phƣơng trình (2):
Pa(x) = (a + b)2 - b2 (2)
Nhân cả hai phƣơng trình (một đại diện cho xác suất xảy ra gắn số iod trên phân tử Ab, một đại diện cho khả năng gắn xảy ra) sẽ cho ra xác suất F(x) tạo thành hợp chất gắn . Nhƣ vậy kết quả gắn kháng thể đơn dịng rituximab với đồng vị phóng xạ 131I cho thấy chất phóng xạ 131I gắn dễ dàng vào phân tử kháng thể bằng phƣơng pháp chloramin T theo hoạt độ riêng. Kết quả cho hiệu suất gắn cao, đạt khoảng 96 - 97%. Q trình gắn phóng xạ theo tỉ lệ mol giữa iod và kháng thể là phù hợp với tính tốn lý thuyết thống kê tốn học.
0 5000 10000 15000 20000 25000 0 2 4 6 8 10 12 Hoạt độ phóng xạ ( Ci) Phân đoạn (ml) 131I-rituximab 6,6 Ci/g 131I 131I-rituximab 2,0 Ci/g
3.1.6.Kết quả tinh chế phức hợp 131I-rituximab và theo dõi tính ổn định
Hỗn hợp phản ứng có chứa phức hợp miễn dịch phóng xạ 131I-rituximab