2.2.2 .Kiểm tra chất lƣợng phức hợp131I-rituximab
2.2.3. Đánh giá khả năng gắn với tếbào ung thƣ
2.2.3.1. Nuôi cấy và tăng sinh, thu hoạch tế bào ung thư Raji: Tế bào Raji sau khi
rã đông đƣợc nuôi cấy trong chai 75cm2 chứa mơi trƣờng RPMI có bổ sung thêm 10% FBS và 1% Penicillin/Streptomycin. Số lƣợng tế bào khi gieo là 0,3 x 106 tế bào/chai, đặt chai nuôi vào tủ nuôi cấy tế bào, duy trì nhiệt độ ở 370C và nồng độ CO2 là 5%. Kiểm tra tế bào và thay môi trƣờng 2-3 lần/ tuần. Sau 1-2 tuần nuôi cấy, tế bào phát triển, khi đạt mật độ khoảng 80%, tiến hành tách tế bào để cấy chuyền sang 4 chai nuôi mới. Sau thời gian nuôi cấy 8 -10 ngày, đếm số lƣợng tế bào trên buồng đếm hồng cầu. Tế bào đƣợc rửa sạch với đệm phosphat, ly tâm loại bỏ mơi trƣờng ni cấy, thêm đệm PBS để có nồng độ tế bào là 107 tế bào/ml [Andreas O. Schaffland, 2004].
2.2.3.2.Đánh giá khả năng gắn tế bào với phức hợp 131I-rituximab: Để kiểm tra
hoạt tính gắn (% binding) của kháng thể sau khi gắn với đồng vị phóng xạ, cho phức hợp 131I-rituximab (10 ng kháng thể, 150.000 CPM/ống) gắn với một lƣợng tế bào ung thƣ Raji theo nồng độ tăng dần là 0,01 x 106; 0,02 x 106, 1 x 106; 5 x 106; 8 x 106; 107 tế bào, theo phƣơng pháp Lindmo và cộng sự [Lindmo T., 1984] dùng
100 l đệm PBS 0,15 mM, pH 7 (n=2). Các ống gắn không đặc hiệu Non Specific
Binding (NSB) đƣợc thêm kháng thể đơn dịng rituximab khơng phóng xạ 50 l
ml, nhiệt độ 370C trong 120 phút. Phức tách ra bằng cách ly tâm tốc độ 3400 rpm, 10 phút, tách phần dung dịch và phần lắng, rửa và ly tâm hai lần, sau cùng thu lấy phần tế bào gắn phóng xạ, đo hoạt độ phóng xạ. Tính phần trăm số tế bào gắn so với tổng hoạt độ phóng xạ đƣa vào.
Để tính hằng số cân bằng Kd và khả năng gắn cực đại Bmax của 131I- rituximab, áp dụng phƣơng pháp saturation binding assay của các tác giả Konishi và cộng sự dựa trên phƣơng pháp Lindmo có cải biến [Konishi S., 2004], [M. F. Leahy, 2008], đó là cho tế bào một lƣợng cố định gắn với một lƣợng 131I-rituximab thay đổi theo nồng độ mol. Cho vào các ống thủy tinh (n=2) 100 l đệm phosphat
0,15 mM, pH 7,2, lƣợng tế bào trong mỗi ống SA (specific binding) là 0,5 x 106.
131I-rituximabhoạt độ riêng 0,74 GBq/mgđƣợc cho vào các ống SA với nồng độ 1,6; 3,2; 6,4; 12,9; 25,7; 51,5; 103,1nmol/L. Các ống NSB đƣợc thêm vào một lƣợng 50
l (500 g) rituximab và ủ trƣớc ở 40C, 60 phút. Sau khi cho tế bào vào các ống, tổng thể tích trong mỗi ống là 0,3 ml, ủ tất cả các ống ở 370C, 120 phút. Sau khi ủ, đo hoạt độ phóng xạ của các ống, hút tế bào cho vào các lỗ trên khay milipore, lắp trên hệ lọc milipore, bật bơm hút hết phần dung dịch, các tế bào đƣợc rửa bằng đệm phosphat 3 lần, thu màng lọc chứa tế bào, đo hoạt độ phóng xạ trên máy đo gamma cùng với ống tổng. Tính đặc hiệu của kháng thể đƣợc xác định dựa trên hằng số Bmax và Kd bằng phƣơng pháp phân tích Schatchard [dùng phần mềm Graphpad Prism 7,01 [Irina V, 2005], [Edward C Hulme, 2010]. Kết quả tính theo phƣơng trình sau: B [Ab] = −1 Kd × B + Bmax Kd
[Ab]: nồng độ của antibody, B: Bound (phức kháng thể gắn với tế bào), Kd là hằng số cân bằng - phân ly, Bmax là giá trị cực đại của 131I-rituximab gắn trên mỗi tế bào.
2.2.3.3.Kiểm tra hoạt tính miễn dịch của 131I-rituximab với tế bào bạch cầu bệnh
nhân NHL:Thực nghiệm gắn 131I-rituximab với tế bào đƣợc tiến hành theo phƣơng
đoán là u lympho ác tính khơng Hodgkin (ULAKH), có dấu ấn CD20 (+) [Pescovitz, M. D.2006], [Boyum A., 2009].
Lựa chọn bệnh nhân: 15 bệnh nhân mới đƣợc chẩn đoán xác định NHL tế
bào B, CD 20 dƣơng tính, hoặc bệnh nhân tái phát. Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu. Tiến hành lấy 15 mẫu máu của 15 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn lựa chọn. Lấy 4 - 6 ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đông EDTA, bảo quản ở nhiệt độ phòng và xử lý mẫu trong ngày. Sử dụng kỹ thuật tách bạch cầu lympho máu ngoại vi bằng dung dịch Ficoll.
Hình 2.1. Hình ảnh bệnh ULKH (A: Bệnh nhân biểu hiện tại hạch cổ trái
B: Bệnh nhân NHL tế bào lympho mang CD20 dƣơng tính)
Quy trình tách bạch cầu lympho dùng dung dịch Ficoll: Lấy 2 ml mẫu máu
toàn phần vào ống nghiệm chứa EDTA, chú ý khơng làm vỡ hồng cầu. Hịa lỗng máu toàn phần bằng thể tích tƣơng ứng 1:1 với dung dịch NaCl 0,9 %. Hút 2 ml dung dịch Ficoll vào ống nghiệm đáy trịn dung tích 10 ml. Sau đó hút dung dịch máu đã pha loãng bằng pipet Pasteur đặt nhẹ lên trên dung dịch Ficoll và ly tâm với tốc độ 2400 rpm trong 20 phút ở nhiệt độ 220C. Lấy các ống nghiệm thủy tinh có thể tích 10 ml, vô trùng, cho vào sẵn 5 ml dung dịch NaCl 0,9%. Hút bỏ phần huyết tƣơng trên cùng cách vịng nhẫn khoảng 2 cm, sau đó hút vịng nhẫn tế bào kèm theo huyết tƣơng xuống 1 cm cho sang ống nghiệm chứa sẵn 5 ml dung dịch NaCl 0,9%, ly tâm 1500 rpm trong 10 phút. Bỏ dung dịch nổi, làm tan khối tế bào bằng cách lắc trộn nhẹ dùng máy vortex. Sau đó rửa khối tế bào 2 lần bằng cách lặp lại cách rửa bằng cách ly tâm trong dung dịch NaCl 0,9%. Sau khi rửa xong, đánh tan
khối tế bào bằng 1ml RPMI. Mẫu máu của 15 bệnh nhân (đánh số từ M1 đến M15) đƣợc tách lấy tế bào bạch cầu, các mẫu đủ số lƣợng tế bào làm ống đôi, các mẫu không đủ số lƣợng tế bào làm ống đơn.
Quy trình gắn tế bào với phức hợp 131I-rituximab[Lindmo T.,1984]:Cho vào
các ống thủy tinh đáy tròn một lƣợng đệm PBS 0,15 mM, pH 7, sau đó cho kháng thể đơn dịng rituximab khơng phóng xạ vào các ống để làm ống gắn không đặc hiệu (Non Specific Binding: NSB). Hai ống tổng khơng cho gì thêm chỉ có phức hợp phóng xạ 131I-rituximab. Các ống thực nghiệm gắn cho thêm một lƣợng tế bào từ 102 đến 106, sau đó thêm vào một lƣợng 131I-rituximab với hoạt độ phóng xạ nhƣ nhau là 150.000 CPM trong mỗi ống. Thể tích ủ là 1,0 ml, nhiệt độ 370C trong 120 phút. Phức tách ra bằng cách ly tâm tốc độ 3400 rpm, 10 phút, tách phần dung dịch và phần lắng, rửa và ly tâm hai lần, sau cùng thu lấy phần tế bào gắn phóng xạ, đo hoạt độ phóng xạ các ống tế bào. Tính phần trăm số tế bào gắn so với tổng hoạt độ phóng xạ đƣa vào[Edward C. Hulme, 2010].
2.2.3.4.Kiểm tra hoạt tính miễn dịch của phức hợp 131I-rituximabvới kháng nguyên
CD20
Kháng nguyên CD20 đƣợc cố định lên cột sắc ký ái lực dựa trên ái lực của NTA agarose với đuôi histag trên phân tử kháng nguyên CD20. Sau khi gắn kháng nguyên CD20 lên cột niken NTA agarose, phức kháng thể 131I-rituximab đƣợc ủ với kháng nguyên CD20 trên cột, phản ứng gắn đặc hiệu thực hiện trong đệm tris-HCl, Sau khi ủ, lấy hạt ra, rửa với Tris-HCl nhiều lần, lần sau cùng thay bằng đệm phosphate PBS, rửa và chắt ra cho hết dung dịch. Sau đó cho dung dịch 131I- rituximab với hoạt độ phóng xạ 180.000 CPM/4,4 mol vào dung dịch hạt đã gắn
kháng nguyên, phản ứng kháng nguyên kháng thể xảy ra trong vòng 90 phút, trong đệm phosphat pH 7,2. Lắc trộn đều trên máy lắc trong cả quá trình ủ, ở nhiệt độ phịng, sau đó tách phần gắn không đặc hiệu và phần tự do ra đo hoạt độ phóng xạ và tính tốn phần trăm hoạt tính gắn.
2.2.4. Đánh giá phân bố và đào thải và an toàn trên động vật thực nghiệm:
Chuẩn bị: Chuột nhắt trắng gồm 30 con, trọng lƣợng 18 - 22g chia thành 6
nhóm. Pha lỗng 131I-rituximab bằng nƣớc muối sinh lý để có nồng độ phóng xạ là 1mCi/ml (37 MBq/ml). Các thiết bị và dụng cụ cần thiết nhƣ cân, máy đo gamma, xyranh, kim tiêm, ống đựng mẫu, pipet, găng tay, bông, cồn, ether, khay nhựa.
Thực hiện: Cho chuột uống lugol 1% trƣớc khi tiêm thuốc và cho uống mỗi
ngày một lần vào buổi sáng trong suốt thời gian làm thí nghiệm đối với nhóm chuột tiêm 131I-rituximab. Cân ống và cân trọng lƣợng chuột. Hút 131I-rituximab vào xyranh, cân xyranh có dung dịch, sau khi tiêm xong cân lại xyranh để tính lƣợng dung dịch tiêm vào. Tiêm vào tĩnh mạch đuôi mỗi con chuột 100l (100Ci) dung dịch 131I-rituximab, ghi lại thời gian tiêm. Sau khi đủ thời gian tiêm 1, 6, 24, 48, 72, 192 giờ, các nhóm chuột đƣợc mổ lấy các cơ quan nội tạng cho vào ống gồm máu, tim, gan, lách, thận, phổi, cơ, xƣơng, ruột, dạ dày và tuyến giáp. Tất cả đem cân và đo đếm phóng xạ.
Cách pha mẫu chuẩn: Lấy 100l dung dịch thuốc phóng xạ pha lỗng với
NaCl 0,9% thành 25ml. Sau đó, dung dịch này đƣợc đƣợc chia vào 3 ống, mỗi ống 1 ml để làm mẫu chuẩn. Các ống chuẩn này đƣợc đo cùng thời điểm với các mẫu mô khi đủ thời gian. Các cơ quan đƣợc đem cân, máu cũng đƣợc cân riêng và đo đếm, tổng hoạt độ trong máu đƣợc tính tốn bằng 7% trọng lƣợng cơ thể. Đối với cơ tính bằng 40% và xƣơng tính bằng 10% trọng lƣợng cơ thể. Tổng hoạt độ tiêm vào cơ thể chuột đƣợc tính bằng hoạt độ trong bơm tiêm trừ đi hoạt độ tại vị trí tiêm của đi. Kết quả cuối cùng tính bằng giá trị phần trăm liều tiêm (% ID) trên gam hoặc tổng số đếm DPM trên gam (DPM/g hoặc DPM/mg).
% Liều tiêm ID =Liều trong mô hoặc cơ quan
Liều tiêm vào động vật × 100
% Liều tiêm/g (ID%/g ) = % Liều tiêm
Khối lƣợng của mô hoặc cơ quan
- Cách tính liều trong mơ hoặc cơ quan: Lấy số đếm trong mỗi mẫu chia cho trọng lƣợng cân đƣợc của mẫu đó (số đếm trên gam). Nhân số đếm trên gam với
tổng trọng lƣợng cơ quan (theo gam và phần trăm trọng lƣợng cơ quan trong cơ thể). Lấy kết quả của liều tiêm trong mỗi nhóm 5 con chuột ( SD).
Liều trong mô/cơ quan = Sốđếm mẫu
Trọng lƣợng mẫu× Trọng lƣợng chuột × % mơ
Kết quả cuối cùng tính bằng giá trị phần trăm liều tiêm (ID%) hoặc phần trăm liều tiêm trên gam. Số đếm chuẩn (standard) đƣợc tính bằng cách lấy số đếm của 1 ml dung dịch phóng xạ chuẩn (bằng số đếm trung bình của 3 ống) nhân cho trọng lƣợng thực của dung dịch nhân cho 25 ml. Đem kết quả chia cho trọng lƣợng thực của 100µl dung dịch cân đƣợc. Cuối cùng lấy kết quả trừ cho số đếm của đi ta có đƣợc số đếm chuẩn xem nhƣ là liều tiêm vào động vật. Số đếm này đƣợc đếm vào thời điểm đếm các cơ quan của chuột, ống chuẩn đƣợc đếm trƣớc:
Sốđếm chuẩn = Sốđếm 1ml x trọng lượng dd x 25 ml
Trọng lượng thực của 100µl dung dịch−Sốđếm đi
Chụp hình phân bố 131I-rituximab trên thỏ:
Chọn 30 con thỏ, chia thành 6 nhóm, mỗi nhóm 5 con. Tiêm tiền liều bằng rituximab, mỗi con 100 mcg theo đƣờng tĩnh mạch tai. Sau đó tiêm thỏ theo các nhóm với liều 131I-rituximab là 500 Ci, 1000 Ci, 1500 Ci, 2000 Ci và 5000 Ci . Nhóm đối chứng tiêm nƣớc muối sinh lý 0,9%. Thỏ đƣợc gây mê bằng
thiopental liều 50mg/kg và chụp hình phân bố thuốc trên máy máy xạ hình SPECT với tốc độ 10 cm/ phút, độ phân giải 256 x 1024 pixel tại các thời điểm sau tiêm theo các khoảng thời gian 1 giờ, 6 giờ, 24 giờ, 48 giờ , 72 giờ và 168 giờ.
2.2.4.2. Kiểm tra đào thải 131I-rituximab trên thỏ
Thỏ thí nghiệm chia thành 6 nhóm, mỗi nhóm 5 con nhƣ trong thí nghiệm chụp hình phân bố thuốc. Tiêm thỏ theo các nhóm với liều 131I-rituximab là 500
Ci, 1000 Ci, 1500 Ci, 2000 Ci và 5000 Ci . Nhóm đối chứng tiêm nƣớc muối
sinh lý 0,9%. Thỏ đƣợc gây mê bằng thiopental liều 50mg/kg và chụp xạ hình phân bố thuốc trên máy máy xạ hình SPECT với tốc độ 10 cm/ phút, độ phân giải 256 x 1024 pixel tại các thời điểm sau tiêm theo các khoảng thời gian 1 giờ, 6 giờ, 24 giờ,
48 giờ , 72 giờ và 168 giờ. Xác định đào thải thuốc bằng các thông số Kcount trên máy SPECT.
2.2.4.3. Kiểm tra tính an tồn của 131I-rituximab trên động vật thí nghiệm
- Kiểm tra hoạt tính của phức hợp 131I-rituximab trƣớc khi tiêm: Hợp chất gắn đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp sắc ký nhanh (TCC): Chấm 5 µl dung dịch mẫu sản phẩm lên băng giấy sắc ký TCC, BIODEX, Mỹ. Quá trình sắc ký đƣợc thực hiện bằng cách nhúng băng giấy đã chấm mẫu vào trong buồng sắc ký chứa dung dịch NaCl 0,9%. Sắc ký nhanh đƣợc thực hiện trong vòng 1-2 phút. Phần
131I tự do di chuyển về vị trí số 2 trên băng giấy (Rf = 0,9 - 1), lấy băng giấy sắc ký ra, cắt đôi và đo phóng xạ mỗi phần, phần phức kháng thể 131I-rituximabnằm tại điểm gốc (Rf = 0).Tỉ lệ hoạt độ phóng xạ của phức hợp 131I-rituximab bảo đảm trên 99,0%.
- Chuẩn bị 131I-rituximab trƣớc tiêm: Pha lỗng thuốc phóng xạ với NaCl 0.9% đến nồng độ 0,5 mCi/ml; 1,0 mCi/ml); 1,5 mCi/ml; 2,0 mCi/ml; 5 mCi/ml để tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ.
- Cho thỏ uống dung dịch lugol bảo vệ tuyến giáp: cho thỏ uống 1 ngày trƣớc tiêm 20 giọt và 14 ngày sau tiêm 131I-rituximab, liên tục mỗi ngày 10 giọt lugol 5%. Mục đích tạo bão hịa lƣợng iod trong tế bào tuyến giáp, tránh hiện tƣợng tế bào tuyến giáp bắt giữ 131I.
- Tiền liều rituximab: Rituximab đƣợc tiêm với liều 100 mcg/thỏ theo đƣờng tĩnh mạch tai trƣớc khi tiêm 131I-rituximab 1 giờ. Sau đó, tiêm131I-rituximab hoặc nƣớc muối theo liều phân nhóm ở trên.
Các chỉ tiêu theo dõi:Mỗi thỏ đƣợc lập phiếu theo dõi. Các chỉ tiêu theo dõi
bao gồm tình trạng tồn thân, trọng lƣợng thỏ, nhiệt độ cơ thể, khả năng ăn uống, phân, tình trạng nhiễm độc nhiễm khuẩn, tỷ lệ sống, chết.
- Kiểm tra công thức máu: trƣớc khi tiến hành thí nghiệm, sau 3 ngày, sau 8 ngày: Đánh giá biến đổi của các thông số về hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu đƣợc tiến hành trên máy xét nghiệm huyết học tự động.
- Đánh giá các chỉ số sinh hóa chức năng gan, thận: trƣớc khi tiến hành thí
nghiệm, sau 3 ngày, sau 8 ngày. Đánh giá biến đổi về nồng độ SGOT, SGPT, Ure và Creatinin huyết thanh bằng phƣơng pháp quang động học đo hoạt tính enzyme đã đƣợc mơ tả bởi các tác giả Allain C (1974), Werner M (1998), Izawa S. (1997). Đây là xét nghiệm thƣờng qui đƣợc tiến hành trên hệ thống hố sinh tự động.
Hình 2.2. Cho thỏ uống lugol, đo nhiệt độ thỏ
Phẫu tích đánh giá hình ảnh mơ bệnh học của gan và thận: Sau khi tiêm theo
thời gian, thỏ đƣợc giết chết bằng gây tắc mạch não với khơng khí tiêm tĩnh mạch . Tiến hành mổ lấy mô gan và thận , cố đi ̣nh trong formon , chuyển đúc trong paraphin. Sau đó cắt nhuô ̣m tiêu bản mô bê ̣nh ho ̣c bằng Hemalium -Eosin (HE). Các tiêu bản đƣợc đo ̣c dƣới kính hiển vi quang ho ̣c độ phóng đại 10x và 40x. Đánh giá biển đổi về vi thể mô gan và thận nhƣ thay đổi về tế bào, mạch máu.
2.2.5.Xử lý kết quả
Các kết quả nghiên cứu đƣợc xử lý theo các thuật toán thống kê y học. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05. Sử dụng các phần mềm Biochrom, phần mềm OptiQuant 5.0 để tính độ tinh khiêt hóa phóng xạ; Sử dụng phần mềm GraphPad prism 7 tính hằng số cân bằng phân ly. Phân tích đánh giá tính an tồn bằng xử lý thống kê dùng phần mềm SPSS 16.0.
2.2.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của 131I-rituximab
Các tiêu chuẩn cơ sở đƣợc xây dựng dựa trên các chỉ tiêu chất lƣợng của
Sơ đồ nghiên cứu chung đƣợc trình bày trong Hình 2.3 nhƣ sau:
Hình 2.3.Sơ đồ quá trình điều chế 131I-rituximab Khảo sát các điều
kiện tối ƣu điều chế
131I-rituximab
Kiểm tra chất lƣợng
131I-rituximab Đánh giá tính an tồn của 131I-rituximab
Nghiên cứu điều chế
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát điều chế phức hợp 131I-rituximab. 3.1. Kết quả khảo sát điều chế phức hợp 131I-rituximab.
3.1.1. Kết quả khảo sát nồng độchloramin T tham gia trong phản ứng tạo phức hợp 131I-rituximab