CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DA
Để xác định DA cũng như các chất thuộc nhóm catecholamin khác trong mẫu sinh học các phương pháp được áp dụng phổ biến nhất gồm sắc ký lỏng ghép nối cảm biến huỳnh quang (HPLC/FL), sắc ký lỏng ghép nối cảm biến điện hóa (HPLC/ECD), sắc ký lỏng ghép nối cảm biến khối phổ (HPLC/MS),
và phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) [7, 105]... Trong đó, phương pháp điện hóa với điện cực biến tính được sử dụng cho các phép đo trực tiếp trên cơ thể [43, 65, 89, 115]. Hàm lượng bình thường của DA trong huyết tương và trong nước tiểu/ 24 giờ theo khuyến cáo của các cơ sở y tế và tài liệu tham khảo được chỉ ra ở Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Hàm lượng bình thường dopamin trong mẫu sinh học
STT Loại mẫu/ chỉ tiêu Hàm lượng bình thường (DA)
1 Mẫu huyết tương ≤ 100 pg/ mL
2 Mẫu nước tiểu/ 24 giờ ≤ 600 µg/ 24 giờ (3900 nmol/ 24 giờ)
3 Trực tiếp trong cơ thể 10 nM–1 µM [96]
Trong cơ thể DA ở ngưỡng nồng độ nanomol và trong hệ thần kinh nồng độ DA liên tục thay đổi bởi nhiều yếu tố phức tạp. Do đó, phân tích dopamin địi hỏi quy trình đặc biệt, tiêu tốn nhiều thời gian chuẩn bị mẫu cũng như phân tích. Các phương pháp phân tích các catecholamin trong đó có dopamin được thừa nhận gồm phương pháp sắc ký lỏng (LC) với cột tách pha đảo và tác nhân tạo cặp ion ghép nối cảm biến điện hóa (ECD), khối phổ (MS), hoặc huỳnh quang (FL) [126]. Do nền mẫu phức tạp với nhiều thành phần gây nhiễu cho tín hiệu phân tích nên các quy trình xử lý mẫu trước khi mẫu được phân tích sắc ký lỏng thường đòi hỏi khắt khe. Các phương pháp phân tích catecholamin bị ảnh hưởng bởi các dược phẩm và thức ăn mà người bệnh sử dụng nên khi xét nghiệm việc yêu cầu tránh sử dụng một số chất cũng là cách giúp kết quả chính xác hơn. Phương pháp khối phổ được áp dụng phân tích các catecholamin cho độ chọn lọc cao dựa trên quy trình xử lý mẫu phù hợp và có ưu điểm là độ đặc hiệu cao. Ngoài ra, phương pháp miễn dịch liên kết enzym (ELISA) với ưu điểm thời gian phân tích tương đối nhanh nên được ứng dụng phổ biến trong thực tế để phân tích mẫu máu, mẫu nước tiểu. Các phương pháp phân tích này đều cần các trang thiết bị hiện đại, kinh phí đầu tư ban đầu lớn, chi phí và thời
gian chuẩn bị mẫu cao, thử nghiệm viên phải được đào tạo chuyên sâu. Dưới đây là tổng quan những ưu điểm và hạn chế của từng phương pháp.
1.2.1. Phương pháp huỳnh quang
Các phân tử catecholamin có nhóm chức phenolic nên có thể trực tiếp phân tích phổ huỳnh quang với bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng 280 nm và 310 nm. Phương pháp huỳnh quang chủ yếu được vận dụng để chế tạo đe-tec-tơ ghép nối với các hệ tách chất như sắc ký lỏng, điện di. So với đe-tec- tơ điện hóa, đe-tec-tơ huỳnh quang dễ vận hành và phổ biến hơn. Để gia tăng độ nhạy và phạm vi ứng dụng, các cột dẫn xuất hóa được sử dụng để dẫn xuất các phân tử catecholamin nhằm gia tăng tính chất huỳnh quang trước khi đi vào hệ phân tích [2, 128, 164].
Đã có rất nhiều thuốc thử huỳnh quang khác nhau được sử dụng để dẫn xuất hóa các catecholamin. Trong hệ thống phân tích, các catecholamin được chạy qua một cột dẫn xuất hóa (cịn gọi là tiền cột), tại đây catecholamin được tác dụng với thuốc thử huỳnh quang tạo thành dẫn xuất có huỳnh quang trước khi được tách trong hệ sắc ký lỏng hoặc điện di mao quản và phát hiện ở đe- tec-tơ huỳnh quang.
Ví dụ, hệ sắc ký lỏng pha đảo gồm cột tách C18, đe-tec-tơ huỳnh quang có bước sóng kích thích phổ 220 nm và tia phát xạ bước sóng 320 nm được áp dụng xác định trực tiếp và đồng thời với độ nhạy 2,5 đến 25 pmol đối với norepinephrin, octopamin, epinephrin, dopamin, dihydroxyphenylalanin, tyramin, tyrosin, serotonin, 5-hydroxytryptophan, N-axetyl-serotonin và tryptophan [11].
Bằng hệ HPLC có cột dẫn xuất hóa được tối ưu các thơng số với thuốc thử huỳnh quang là 1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazol-9-ethyl chloroformat, DA và nhiều hợp chất khác trong mẫu tế bào não của chuột đã được phân tích chính xác và chọn lọc cao [149].
Catecholamin cũng được nghiên cứu để phân tích bằng phương pháp điện di mao quản ghép nối cảm biến huỳnh quang. Phương pháp điện di thích hợp cho yêu cầu phân tích với lượng mẫu nhỏ. Tương tự như phương pháp HPLC, để ứng dụng phương pháp điện di mao quản thì các catecholamin cũng thường được dẫn xuất hóa. Ví dụ, Các hợp chất catecholamin gồm DA và 3,4- dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), DOPA, epinephrin (E), norepinephrin (NE) và 3,4-dihydroxyphenyl glycol (DOPAG) trong mẫu nước tiểu đã được phân tích bằng phương pháp điện di mao quản với dung dịch đệm borat làm nền chất điện ly. Phản ứng tạo phức của các chất cần phân tích với terbi (III) clorua và EDTA tạo phức phát quang mạnh catechol-EDTA-Terbi với bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng ở 300 nm và 545 nm. Giới hạn phát hiện của phương pháp đạt đến 10-7 mol/L. Phương pháp có thể áp dụng phân tích mẫu nước tiểu sau khi xử lý mẫu bằng quy trình làm sạch và làm giàu [129].
Một số thuốc thử để dẫn xuất hóa catecholamin gồm o-phthaldehyt, naphthalen-2; 3-dicacboxaldehyt; 5-Furoylquinoline-3-carboxaldehyt; fluorescein isothiocyanat; n-hydroxysuccinimidyl fluorescein-O-axetat; 4- fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol; ethylenediamin; benzylamin; 1,2- diphenyl-etylen-diamin; 1,2-phenylenediamin; terbium (III) [129].
1.2.2. Phương pháp khối phổ
Phương pháp khối phổ có độ đặc hiệu cao cho phép nhận dạng chất trong nền mẫu phức tạp và cung cấp thông tin về cấu trúc các chất. Phương pháp này được ứng dụng phân tích DA cũng như các catecholamin khác [72, 124]. Đe- tec-tơ khối phổ ghép nối với các hệ thiết bị tách chất như LC và CE là những hệ thống trang bị hiện đại được sử dụng ngày càng phổ biến. Phương pháp ghép nối khối phổ kép (HPLC-MS/MS) là một hệ thiết bị mới với nhiều ưu việt khi áp dụng phân tích các catecholamin sau khi mẫu được chuẩn bị bằng các quy trình chiết tách tối ưu [150].
Ví dụ, đồng thời epinephrin, norepinephrin, DA và 5-hydroxytryptamin được phân tích nhanh và chính xác bằng hệ HPLC-MS với cột tách pha đảo và hệ ion hóa hóa học ở áp suất thường với chế độ ion hóa ion dương. Q trình hóa hơi (nebulization) được thực hiện ở 300oC với áp suất 50 psi trong dịng khí khơ N2 tốc độ 12 lít/ phút. Các mảnh phổ để định lượng có m/z là 152, 166, 137 và 160 tương ứng với epinephrin, norepinephrin, DA và 5- hydroxytryptamin [131].
Ví dụ, các catecholamin được chiết từ 300 µL mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng đặc hiệu cho các hợp chất chứa nhóm catechol. Sau đó mẫu được phân tích trên thiết bị khối phổ với phương pháp ion hóa bằng chùm tia điện tử (ESI-MS/MS). Phần tách chất bằng HPLC không sử dụng tác nhân tạo cặp ion. Các phân tử catecholamin mang đồng vị bền được sử dụng làm chất chuẩn nội. Epinephrin, norepinephrin và dopamin được phân tích trong khoảng thời gian 3,5 phút. Giới hạn định lượng 2,5 g/L cho epinephrin và DA, 10 g/L cho norepinephrin. Độ sai lệch (CV) < 9,6%; hiệu suất thu hồi đạt 71 ± 12 % [126].
Ví dụ, phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối khối phổ kép (UPLC-MS/MS) đã được xây dựng để phân tích mẫu dịch vi thẩm tách não người bởi các nhà khoa học Phần Lan và Thụy Điển. Hệ thiết bị UPLC-MS/MS được sử dụng là AquityUPLC của hãng Waters ghép nối với cảm biến khối phổ ba tứ cực Agilent 6410 (do hãng Agilent technologies sản xuất), cột tách sử dụng là cột pentaflorophenyl (Gold PFP Hypersil, hãng sản xuất Thermo Scientific) kích thước 2,1×150 mm, đường kính trong 1,9 mm. Nghiên cứu này đã phân tích được DA, serotonin (5-HT) và nhiều chất khác trong mẫu dịch vi thẩm tách thu từ hai bệnh nhân bị tổn thương não cấp tính, dịch não thất thu từ bốn bệnh nhân bị tràn dịch não [120]. Kết quả cho thấy phương pháp không chỉ
cho độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao mà cịn được ứng dụng lắp đặt ngay tại giường bệnh để đo liên tục nhằm quan trắc tình trạng bệnh nhân.
1.2.3. Phương pháp miễn dịch liên kết enzym (ELISA)
Phương pháp ELISA là phương pháp thử nghiệm trên cơ sở hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym để phát hiện và định lượng peptit, protein, kháng thể và các độc tố, phân tử sinh học, vi khuẩn, vi rút. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên tính đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể liên kết với một enzym. Phân tích kết quả bằng tín hiệu quang khi cơ chất phản ứng với enzym. Trên cơ sở nguyên tắc của phương pháp ELISA, có rất nhiều hãng thiết bị đã xây dựng phương pháp và thiết kế thiết bị để xác định DA như hãng Genway, DLD, IBL, Biolegend… [46, 61] được ứng dụng phân tích mẫu sinh học trong y tế. Trong các phương pháp này, DA được chiết từ mẫu sinh học bằng gel ái lực cis-diol nhờ lớp boronat trên thành đĩa giếng để loại các tạp chất. Sau khi được giữ trên gel ái lực boronat, DA được rửa sạch rồi axetylat hóa thành N- axyldopamin sau đó dẫn xuất hóa dưới tác dụng của enzym thành N-axyl-3- metoxytyramin.
Đĩa giếng được gắn kháng thể do dê tạo ra khi được tiêm kháng nguyên từ thỏ (goat anti rabbit). DA trong các mẫu sau khi được chiết và axetylat hóa đóng vai trị kháng nguyên được đưa vào giếng và được kháng thể trong đĩa giếng giữ lại. Một kháng thể khác có liên kết enzym photphataza kiềm tính được thêm vào đĩa giếng sẽ tác dụng đặc hiệu với kháng nguyên. Khi dung dịch cơ chất là p-nitrophenyl photphat được thêm vào, nhờ tác dụng của enzym trên kháng thể thứ cấp, phản ứng chuyển hóa cơ chất xảy ra tạo tín hiệu phân tích tỷ lệ với nồng độ DA trong mẫu.
1.2.4. Phương pháp điện hóa
Do có tính điện hoạt cao và dễ dàng phản ứng oxi hóa khử nên phương pháp điện hóa được ứng dụng hiệu quả để phân tích DA [113, 158]. Phương
pháp điện hóa được ứng dụng xác định DA gồm chế tạo các đe-tec-tơ điện hóa và phương pháp điện hóa trực tiếp với điện cực làm việc phù hợp. Các đe-tec- tơ điện hóa được chế tạo để ghép nối với các hệ thống tách chất như sắc ký, điện di nhằm tăng tính chọn lọc [37]. Phương pháp điện hóa có bản chất là các q trình hoặc phản ứng điện hóa chủ yếu ở lớp tiếp xúc điện cực và dung dịch đo. Hai nhóm kỹ thuật điện hóa chính là đo dịng với điện thế khơng đổi (potentiostatic) và đo kiểm sốt điện thế (potentiometric). Cả hai phương pháp cần ít nhất hai điện cực và dung dịch điện ly. Một trong hai điện cực phản ứng với chất điện ly được gọi là điện cực làm việc (còn gọi là điện cực chỉ thị). Điện cực còn lại là điện cực so sánh, điện thế của điện cực so sánh không thay đổi do có bản chất độc lập với hệ [138]. Phương pháp kiểm soát điện thế liên quan đến các q trình chuyển điện tích ở lớp tiếp xúc điện cực và dung dịch. Điện thế được sử dụng để tác động các q trình trao đổi điện tích làm thay đổi dịng điện. Cường độ dịng điện vì vậy phản ánh tốc độ trao đổi điện tử giữa chất oxi hóa và chất khử. Trong phương pháp kiểm sốt điện thế, dịng điện được đo là dòng Faraday, tức dịng điện phát sinh do q trình chuyển trạng thái oxi hóa khử của chất điện hoạt và nó tuân theo định luật Faraday (lượng chất tỷ lệ thuận với lượng điện chuyển qua).
1.2.4.1. Các đe-tec-tơ điện hóa
Đe-tec-tơ điện hóa có ưu điểm về độ nhạy khi ứng dụng xác định các chất điện hoạt như DA. Độ nhạy đe-tec-tơ tử ngoại (UV) khoảng 10-8 g/mL, đe- tec-tơ mảng di-ot (DAD) khoảng 10-9 g/ mL, đe-tec-tơ huỳnh quang 10-11 g/mL, đe-tec-tơ khối phổ và đe-tec-tơ điện hóa khoảng 10-11 g/mL. Đe-tec-tơ điện hóa thường có độ đặc hiệu hơn các đe-tec-tơ quang [101]. Ưu điểm của phương pháp điện hóa là độ nhạy và độ chọn lọc cao, khoảng tuyến tính rộng, trang bị nhỏ gọn và chi phí thấp. Giới hạn phát hiện có thể đạt tới siêu vết (nanomol) với thể tích mẫu vơ cùng nhỏ (5 – 20 µL) nghĩa là lượng chất chỉ từ 10-13–10-15
mol [138]. Độ chọn lọc được tăng lên khi ghép nối với các thiết bị tách chất như sắc ký, điện di.
Hình 1.4. Phản ứng oxi hóa – khử DA
DA thường được phân tích bằng hệ tách LC hoặc điện di ghép nối với đe- tec-tơ điện hóa đo dịng hoặc đo thế (LC-ECD). Phương pháp điện hóa xác định DA dùng điện cực làm việc là glasy cacbon ở điện thế 0,7 đến 0,8 V với điện cực so sánh Ag/AgCl [129]. Phương pháp LC-ECD đồng thời phù hợp để phân tích chất truyền dẫn thần kinh và dẫn xuất khác ngoài DA. Các indolamin, catecholamin và dẫn xuất của chúng có tính chất điện hoạt nên có thể xác định bằng phương pháp điện hóa mà khơng cần phải thực hiện các bước dẫn xuất hóa.
Với hệ thống thiết bị sắc ký lỏng ghép nối đe-tec-tơ điện hóa (LC-ECD), đã có rất nhiều cơng trình khoa học được cơng bố ứng dụng phân tích DA và các chất thuộc nhóm catecholamin trong mẫu dược phẩm và mẫu sinh học [145]. Ví dụ, phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối đe-tec-tơ điện hóa (UHPLC-ECD) được các nhà khoa học thuộc Đại học Utrecht-Hà Lan ứng dụng xác định một số chất truyền dẫn thần kinh với lượng mẫu chỉ 10 µL từ dịch vi thẩm tách [116]. Đe-tec-tơ điện hóa là một vi tế bào điện hóa với điện cực làm việc glasy cacbon đường kính 0,7 mm, điện cực so sánh Ag/AgCl. Theo phương pháp này, thời gian phân tích các chất truyền dẫn thần kinh được rút ngắn. Các chất xác định được gồm noradrenalin, DA, serotonin, các dẫn xuất axit homovanillic, axit 5-hydroxyindol axetic, axit 3,4-dihydroxyphenyl axetic. Phương pháp đã được tối ưu để đáp ứng yêu cầu về độ nhạy và thể tích mẫu tiêu tốn nhỏ. Các chất truyền dẫn thần kinh monoamin được xác định với
HO HO NH3+ Dopamin + 2e- + 2H+ Dopamin-o-quinon O O NH3+
giới hạn phát hiện từ 32 đến 83 pmol (0,16 – 0,42 fmol/ 5 µL). Thời gian phân tích khoảng 15 đến 20 phút tùy theo độ phức tạp của nền mẫu.
Một ví dụ khác, phương pháp điện di mao quản ghép nối de-tec-tơ điện hóa (CE-ECD) được nghiên cứu ứng dụng xác định dopamin. Hệ thống thiết bị với nguồn điện thế ± 30 kV; cột mao quản dài 40 cm, đường kính trong 25 µm, đường kính ngồi 360 µm. Đầu vào cột được giữ thế dương, đầu ra của cột được nối đất. Tiêm mẫu vào hệ thống và ổn định điện động học ở 8 kV trong 5 giây. Đe-tec-tơ điện hóa gồm điện cực làm việc cacbon đường kính 300 µm, điện cực đối platin, điện cực so sánh calomel bão hòa. Trước khi đo, điện cực làm việc ln được đánh bóng bằng bột nhơm oxit và siêu âm trong nước cất. Mẫu là mô não của chuột được bảo quản lạnh, đồng hóa trong nước đá với axit pecloric sau đó ly tâm, pha lỗng trong dung dịch đệm axit boric-KOH trước khi tiêm vào hệ thiết bị phân tích. Đe-tec-tơ vận hành ở chế độ đo von-ampe vịng. Kết quả, phương pháp đã phân tích xác định được dopamin và một số chất khác. Giới hạn phát hiện DA đạt 76,9 nmol/ L, khoảng tuyến tính 0,1– 1000 µM [21].
1.2.4.2. Phương pháp điện hóa trực tiếp
Phân tích DA và các chất truyền dẫn thần kinh khác trực tiếp trong mẫu hoặc trên cơ thể sống là một trong những mục tiêu nghiên cứu đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm từ rất sớm. Phương pháp điện hóa được đánh giá có nhiều lợi thế nhất [96]. Các phương pháp điện hóa được áp dụng phân tích các chất truyền dẫn thần kinh có cơ sở từ những cơng trình nghiên cứu của Jaroslav Heyrovsky (giải Nobel Hóa học năm 1959) khi ơng áp dụng nghiên cứu phương pháp cực phổ cho các hợp chất hữu cơ [96]. Từ những năm 1973 đến 1974, nhà khoa học Ralph Adams và cộng sự đã sử dụng các vi điện cực