CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.4. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH MẪU
3.4.1. Quy trình phân tích
3.4.1.1. Ngun tắc
Mẫu dược phẩm hoặc nước tiểu được pha loãng trực tiếp đến nồng độ DA trong khoảng thích hợp vào mơi trường đo tối ưu và đo xung vi phân với điện cực làm việc là điện cực biến tính đã chế tạo thành công. Để định lượng, kỹ thuật phân tích thêm chuẩn hoặc đường chuẩn có thể áp dụng. Trong đó, kỹ thuật thêm chuẩn có ưu điểm hạn chế ảnh hưởng của nền mẫu.
3.4.1.2. Chuẩn bị mẫu
Mẫu dược phẩm
Bẻ ống mẫu và chuyển cẩn thận vào bình định mức dung tích phù hợp, dùng bình tia nước deion tráng sạch ống vào bình định mức. Định mức tới vạch được dung dịch mẫu ban đầu. Từ dung dịch ban đầu này tiếp tục tiến hành pha loãng bằng nước deion nếu cần thiết để được nồng độ phù hợp phương pháp đo. Dung dịch mẫu sau pha loãng tiến hành đo càng sớm càng tốt. Trong trường hợp phải lưu mẫu thì bảo quản ở nhiệt độ ngăn đá tủ lạnh (-18oC), tránh ánh sáng trực tiếp. Nước deion để pha lỗng mẫu được sục khí nitơ để loại bỏ oxi trước khi sử dụng.
Mẫu nước tiểu
Cách lấy mẫu và bảo quản nước tiểu 24 giờ: Cho sẵn vào bình sẽ chứa nước tiểu 10 mL HCl 10% để bảo quản trước khi thu nước tiểu. Bệnh nhân đi
tiểu ra ngồi cho kiệt, bắt đầu tính giờ để từ đó bắt đầu đi tiểu vào bình. Khi đủ 24 giờ, bệnh nhân đi tiểu lần cuối vào bình, thể tích thu được là nước tiểu 24 giờ. Thể tích nước tiểu cần được đo một cách chính xác và được ghi lại. Trường hợp cần bảo quản lâu hơn cần điều chỉnh nước tiểu về pH 4 bằng dung dịch HCl 10 % hoặc NaOH 10 % và bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh (-18oC) cho đến khi phân tích [47, 155].
3.4.1.3. Tiến hành phân tích
Tiến hành đo von-ampe xung vi phân với điều kiện đo tối ưu của từng loại điện cực. Ghi nhận chiều cao píc tín hiệu dịng điện. Có thể áp dụng kỹ thuật định lượng là thêm chuẩn hoặc đường chuẩn.
Quy trình tiến hành phân tích có thể tóm tắt theo sơ đồ sau:
Mẫu dược phẩm/ nước tiểu
Pha loãng, định mức bằng nước deion đã sục khí nitơ (nếu cần thiết)
Lấy V mL hòa tan vào dung dịch đệm
PBS 0,1 M, pH 7 Lấy V mL hòa tan vào dung dịch
đệm PBS 0,1 M, pH 4
Phân tích von-ampe xung vi phân với điện cực làm việc AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE - Khoảng quét thế: - 0,3 đến + 0,7 V - Bước thế (Step potential): 5 mV
- Cường độ xung (Modulation amplitude): 25 mV
- Thời gian áp xung (Modulation time): 0,05 s - Chu kỳ áp xung (Interval time): 0,5 s
Phân tích von-ampe xung vi phân với điện cực làm việc NF-SWCNT/P3MT/GCE
- Khoảng quét thế: + 0,1 đến + 0,7 V - Bước thế (Step potential): 5 mV
- Cường độ xung (Modulation amplitude): 25 mV
- Thời gian áp xung (Modulation time): 0,05 s - Chu kỳ áp xung (Interval time): 0,5 s
Theo phương pháp đường chuẩn:
𝐶𝐷𝐴 = (𝐼𝑥−𝑏
𝑎 ) × 𝑘 (3.7)
Trong đó, CDA là nồng độ dopamin trong mẫu, tính bằng mol/L; k là hệ số pha lỗng; a, b là hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn Ix = CDA + b; Ix là cường độ tín hiệu phân tích khi đo mẫu.
Theo phương pháp thêm chuẩn:
𝐶𝐷𝐴 =𝑏
𝑎× 𝑘 (3.8)
Trong đó, CDA là nồng độ dopamin trong mẫu, tính bằng mol/L; k là hệ số pha lỗng; a, b là hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn Ix = a×∆CDA + b với ∆CDA là khoảng biến thiên nồng độ do thêm chuẩn.
3.4.2. Phân tích DA bằng điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE
Điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE được ứng dụng làm điện cực làm việc để ứng dụng phân tích mẫu thuốc tiêm dopamin và mẫu nước tiểu.
Bảng 3.27. Số liệu về độ chụm xác định nồng độ dopamin trong mẫu thuốc tiêm sử dụng điện cực biến tính NF-SWCNTs/P3MT/GCE
STT Thơng số Đơn vị Kết quả
1 Kết quả phân tích lần 1 mg/mL 39,892 2 Kết quả phân tích lần 2 mg/mL 41,162 3 Kết quả phân tích lần 3 mg/mL 39,563 4 Kết quả phân tích lần 4 mg/mL 40,419 5 Kết quả phân tích lần 5 mg/mL 40,801 6 Kết quả phân tích lần 6 mg/mL 38,911 7 Kết quả phân tích lần 7 mg/mL 40,387 8 Tổng số kết quả lần 7 9 Kết quả trung bình mg/mL 40,16 10 Giá trị đúng mg/mL 40,00
11 Sai khác tương đối % 0,41
12 Độ lệch chuẩn lặp lại Sr mg/mL 0,71 13 Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối RSDr % 1,77 14 Giới hạn lặp lại r (r = 2,8×Sr) mg/mL 2,0
Kết quả kiểm nghiệm mẫu thuốc tiêm 40 mg/ mL DA.HCl như bảng 3.27 cho thấy phương pháp nghiên cứu đã cho kết quả với độ sai khác tương đối chỉ 0,41%. Đồng thời, kết quả phân tích lặp lại mẫu thuốc tiêm có độ chụm tốt với độ lệch chuẩn lặp lại tương đối 1,77 %. Trong kiểm nghiệm dược phẩm kết quả này là hoàn toàn phù hợp.
Phương pháp kiểm nghiệm cũng đã được áp dụng đối với trường hợp mẫu thuốc tiêm được pha lãng để có nồng độ thấp hơn. Bảng 3.28 cho thấy độ chính xác của phương pháp vẫn đảm bảo khi pha loãng mẫu đo.
Bảng 3.28. Phân tích mẫu thuốc tiêm với điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE
STT Mẫu phân tích DA (µM) DA đo được (µM) Sai khác tương đối (%) 1 Thuốc tiêm 6,0 6,14 ± 0,1 (n = 3) 2,33 2 Thuốc tiêm 10,0 10,33 ± 1,0 (n = 3) 3,30
Để đánh giá khả năng ứng dụng đo mẫu nước tiểu, tiến hành phân tích mẫu nước tiểu thêm chuẩn (chuẩn bị như mô tả ở phần 3.4.3) để so sánh kết quả với đơn vị dịch vụ độc lập áp dụng phương pháp ELISA. Kết quả bảng 3.29 cho thấy trong nền mẫu nước tiểu DA đã được tiến hành phân tích với sai khác tương đối 2,07 % so với kết quả so sánh đối chứng.
Bảng 3.29. Phân tích mẫu nước tiểu với điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE
STT Mẫu phân tích Kết quả so
sánh (µM) (*) DA đo được (µM) Sai khác tương đối (%) 1 Nước tiểu thêm
chuẩn 14,94 15,25 ± 1,0 (n = 3) 2,07
(*) Kết quả phân tích của đơn vị dịch vụ độc lập bằng phương pháp ELISA
Như vậy, với điện cực làm việc NF-SWCNTs/P3MT/GCE phương pháp điện hóa đáp ứng yêu cầu áp dụng phân tích mẫu dược phẩm và mẫu nước tiểu.
3.4.3. Phân tích DA bằng điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE
Để đánh giá độ chính xác của phương pháp khi áp dụng phân tích mẫu nước tiểu, thiết lập so sánh kết quả phân tích trên cùng hai mẫu với kết quả của
một đơn vị dịch vụ độc lập bằng phương pháp ELISA. Mẫu nước tiểu 24 giờ được lấy và bảo quản theo đúng quy trình tiêu chuẩn áp dụng trong y tế. Từ mẫu này được chia thành hai phần, phần 1 được tiến hành phân tích nguyên trạng, phần 2 được thêm chuẩn DA để nồng độ tăng lên 10 µmol/L.
Kết quả phân tích bằng phương pháp ELISA mẫu thứ nhất nồng độ DA = 400,15 µg/24 h, với tổng thể tích mẫu nước tiểu V24h = 0,4 lít tính ra nồng độ DA trong mẫu là 6,53 µM. Bằng phương pháp von-ampe với điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE, kết quả thu được nồng độ DA = 6,9 ± 0,3 µM tương đương DA = 420 ± 20 µg/ 24 h.
Đối với mẫu thứ hai được thêm chuẩn, kết quả phân tích bằng phương pháp ELISA là 915,28 µg/ 24 h, tương đương nồng độ DA = 14,94 µM. Kết quả phân tích điện hóa bằng điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE thu được DA = 15,2 ± 0,6 µM tương đương DA = 931,32 ± 30 µg/ 24 h.
Bảng 3.29 là tổng hợp các kết quả phân tích mẫu nước tiểu so sánh hai phương pháp. Sai khác tương đối giữa kết quả thu được từ hai phương pháp là dưới 5%. Như vậy, việc ứng dụng điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE để phân tích điện hóa DA trong mẫu nước tiểu là hoàn toàn phù hợp.
Bảng 3.30. Kết quả phân tích mẫu nước tiểu so sánh phương pháp điện hóa
với điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE và phương pháp ELISA
STT Nền mẫu DA đo được
(µM)
Giá trị quy đổi DA (µg/ 24 h) (*) Kết quả so sánh µg/ 24 h (**) Sai khác tương đối (%) 1 Nước tiểu 6,9 ± 0,3 420 ± 20 400,15 4,96 2 Nước tiểu 15,2 ± 0,6 931,32 ± 30 915,28 1,75
(*) Giá trị quy đổi là giá trị tính quy ra tổng lượng µg DA trong tổng thể tích nước tiểu thu được của một người trong 24 giờ. Ở đây, thể tích mẫu 24 giờ của mẫu so sánh kết quả là V24h = 0,4 lít.
(**) Kết quả so sánh là giá trị được thực hiện bằng phương pháp ELISA bởi đơn vị dịch vụ độc lập.
Bảng 3.31. Số liệu về độ chụm xác định nồng độ DA trong mẫu nước tiểu 10
µM sử dụng điện cực biến tính AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE
STT Thông số Đơn vị Kết quả
1 Kết quả phân tích lần 1 µM 9,876 2 Kết quả phân tích lần 2 µM 9,452 3 Kết quả phân tích lần 3 µM 9,186 4 Kết quả phân tích lần 4 µM 9,654 5 Kết quả phân tích lần 5 µM 9,878 6 Kết quả phân tích lần 6 µM 9,789 7 Kết quả phân tích lần 7 µM 9,688 8 Tổng Số kết quả lần 7 9 Kết quả trung bình µM 9,6 10 Giá trị đúng µM 10
11 Sai khác tương đối % 3,5
12 Độ lệch chuẩn lặp lại Sr µM 0,23
13 Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối RSDr % 2,4
14 Giới hạn lặp lại r µM 0,7
Phương pháp phân tích với điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE là điện cực làm việc có độ chụm tốt. Bảng 3.31 khi phân tích lặp lại mẫu nước tiểu nồng độ 10 µM (được chuẩn bị bằng cách pha loãng mẫu nước tiểu thêm chuẩn ở trên). Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối 2,4% là hoàn toàn phù hợp ứng dụng thực tiễn.
Điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE cũng đã được được khảo sát ứng dụng đối với mẫu thuốc tiêm DA. Sau khi pha loãng mẫu thuốc tiêm và đo kết quả đạt DA.HCl = 40,4 ± 0,5 (n=3) mg/ mL đối với mẫu thuốc 40 mg/mL. Sai khác tương đối 1% là giới hạn sai khác hoàn toàn chấp nhận được.