Phân nhóm Chỉ tiêu n MN% Chung 31 1,018 ±0,494 Giới tính Nam 14 0,992 ±0,406 Nữ 17 1,078 ±0,128 Tuổi ≤ 30 tuổi 8 0,358 ±0,128 >30 tuổi 23 1,247 ±0,339 Cƣ trú ≤ 20 năm 12 0,767 ±0,491 >20 năm 19 1,176 ±0,437 Nghề Nuôi trồng 20 1,239 ±0,390 Khác 11 0,615 ±0,409
Kết quả kiểm định t-test đƣợc tiến hành với số liệu tần số micronuclei giữa các cặp so sánh về giới tính với df = 29, về tuổi nhỏ hơn 30 tuổi với độ tuổi lớn hơn hoặc bằng 30 với df = 29, về thời gian cƣ trú nhỏ hơn 20 năm với thời gian cƣ trú lơn hơn hoặc bằng 20 năm với df = 29 và về nghề nuôi trồng với nghề khác với df = 29. Đánh giá với khoảng t vô hiệu ở xác suất 95% (α = 5%) từ -2.04 đến 2.04 cho thấy có sự giống nhau
với kết quả thống kê về chỉ số đa tâm, mảnh không tâm, đứt nhiễm sắc tử, giá trị thống kê MN cũng khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 2 giới tính. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê xảy ra ở các cặp so sánh về nhóm tuổi, thời gian cƣ trú và nghề.
Kết quả phân tích chỉ số sai hình NST và micronuclei ở nhóm dân cƣ đặc thù trà, cà phê, dâu tằm đã cho thấy sự khác biệt về phổ sai hình NST, trong đó các giá trị đa tâm, mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử cao ở mức giống với nhóm đặc thù nạn nhân chất độc chiến tranh, sự xuất hiện sai hình radical lại giống với nhóm đặc thù nhân viên chẩn đốn hình ảnh .
Bằng chứng sai hình NST ở các đối tƣợng đặc thù mơi trƣờng gồm: nhân viên chẩn đốn hình ảnh ở các bệnh viện, nạn nhân chất độc chiến tranh và những ngƣời sống trong vùng sản xuất thƣờng xuyên sử dụng các loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ, clo hữu cơ đã chỉ ra sự khác thƣờng về kiểu phân loại radical và dƣ NST (Que Tran et al. 2000, 2004) ở các đối tƣợng sử dụng thuốc trừ sâu.
Kết quả cũng chỉ ra mức độ khác thƣờng về tần số các kiểu sai hình mảnh khơng tâm và đứt nhiễm sắc tử ở các nhóm đặc thù nhân viên chẩn đốn hình ảnh và nạn nhân chất độc chiến tranh. Để đánh giá toàn diện vấn đề, kết quả khảo sát đƣợc tiến hành so sánh với kết quả ở nhóm đối tƣợng dân cƣ ngẫu nhiên (3.1) trên bảng 3.13.
Bảng 3.13. So sánh kết quả thống kê giữa 4 nhóm đối tượng khảo sát.
Nhóm
đối tƣợng* n đa tâm /mẫu có
đa tâm (%). Mảnh (%) Đứt NS tử% Tỷ lệ Radical 3.1 104 0,02 ± 0,05 / 22 0,05 ± 0,07 0,10± 0,11 - 3.2.1 30 0,03 /1 0,04 ± 0,06 0,07 ± 0,13 5/30 3.2.2 29 0,03 /1 1,07 ± 1,00 1,27 ± 0,99 - 3.2.3 31 0,05 ±0,06 / 14 0,67 ±0,26 0,83 ±0,28 10/31
* 3.1. Nhóm ngẫu nhiên ;3.2.1. Nhóm hình ảnh ở các bệnh viện ; 3.2.2. Nhóm chất độc chiến tranh ; 3.2.3. Nhóm dân cư Tân Hà.
Kết quả kiểm định t-test đƣợc tiến hành theo cặp số liệu giữa mỗi nhóm đặc thù gồm nhóm nhân viên chẩn đốn hình ảnh, nhóm nạn nhân chất độc chiến tranh và nhóm dân cƣ Tân Hà với nhóm ngẫu nhiên 3.1 với df lần lƣợt là 132, 131 và 133. Đánh giá với khoảng t vô hiệu ở xác suất 95% (a = 5%) từ -1,98 đến 1,98. Kết quả cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tần số mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử xảy ra ở 2 nhóm nạn nhân chất độc chiến tranh và dân cƣ Tân Hà. Kết quả khơng cho thấy có sự khác biệt thống kê có ý nghĩa giữa nhóm nhân viên chẩn đốn hình ảnh so với nhóm ngẫu nhiên, tuy nhiên lại có tỷ lệ radical cao. Hiện trạng sai hình NST tồn tại ở tất cả 4 nhóm đối tƣợng đƣợc khảo sát, sai hình đa tâm và mảnh khơng tâm thuộc kiểu sai hình NST, có cơ chế tái liên kết cặp các mảnh có “đầu dính” do tổn thƣơng DSB trong tế bào. Bằng chứng này chứng tỏ DSB đƣợc tạo ra không chỉ do tác động của mơi trƣờng độc mà cịn do các yếu tố ngẫu nhiên nhƣ bức xạ vũ trụ. Giới hạn của tác động ngẫu nhiên này đƣợc Tonomura đƣa ra công thức y = 2,18.10-4
+ 1,7.10-4 . X, theo đó đa tâm cao hơn 1/1000 ở độ tuổi > 50. Kết quả khảo sát này cho thấy sự phù hợp ở cả 4 nhóm đối tƣợng nghiên cứu và nằm trong giới hạn đƣợc khuyến cáo của IAEA. Giá trị đa tâm <1/1000 khảo sát đƣợc có thể đƣợc khuyến cáo nhƣ là phông ngẫu nhiên trong đo liều phóng xạ ứng phó sự cố, quản lý nhân viên bức xạ và ứng phó nhiễm độc mơi trƣờng tại Việt Nam.
Kết quả thống kê từ bảng 3.13 cho thấy sự tƣơng đồng về mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử giữa nhóm nạn nhân chất độc chiến tranh với nhóm đối tƣợng đặc thù sản xuất nơng nghiệp ở Tân Hà, chúng khác biệt với kết quả từ nhóm ngẫu nhiên và đối tƣợng làm việc chẩn đốn hình ảnh ở bệnh viện. Tuy nhiên kết quả riêng ở nhóm nạn nhân chất độc chiến tranh đã không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa 2 phân nhóm đối tƣợng trực tiếp và đối tƣợng gián tiếp (df = 29, tfra = 0,303, tchb = 0,469) nên không thể kết luận nạn nhân chất độc chiến tranh là nguyên nhân của sự sai khác. Sai hình radical chỉ đƣợc phát hiện ở 2 nhóm đối tƣợng làm việc chẩn đốn hình ảnh ở bệnh viện
và nhóm đối tƣợng nơng dân ở Tân Hà với tỷ lệ tƣơng đối giống nhau. Sai hình đứt nhiễm sắc tử liên quan đến tổn thƣơng SSB, kiểu tổn thƣơng dễ dàng đƣợc phục hồi theo nguyên tắc bổ sung bán bảo thủ. Số liệu phân tích bằng chứng sai hình NST in vitro (các đăng tải của Trần Quế và cộng sự từ 1990 – 2016) đã chứng minh khơng có sự tăng tần số kiểu nhiễm sắc tử ở các mẫu chiếu bức xạ ion hóa, chính vì vậy chỉ số này rất phù hợp để đánh giá tính độc di truyền của các chất hóa học. Sự xuất hiện radical ở nhóm nhân viên chẩn đốn hình ảnh cũng đã đƣợc công bố bởi Vilena K., Ruzika R., Anamarija J. 2008, theo đó Ra% ~ 0,025. Radical là kiểu sai hình nhiễm sắc tử đƣợc hình thành bởi sự tái liên kết các “đầu dính” do tổn thƣơng SSB ở pha G1, các kiểu radical đƣợc phát hiện ở đối tƣợng làm việc chẩn đốn hình ảnh ở bệnh viện và đối tƣợng phát hiện năm 2000 phù hợp với cơ chế đƣợc tổng hợp trong hình 3.6:
Hình 3.6. Cơ chế hình thành radical từ SSB ở pha G1(hình tự vẽ)
Kiểu sai hình NST phụ thuộc vào kiểu tổn thƣơng ADN, phục hồi tổn thƣơng và chu trình tế bào. Thƣờng thì các kiểu sai hình nhiễm sắc tử khơng đƣợc hình thành ở các tế bào bị chiếu xạ do tổn thƣơng SSB đƣợc phục hồi chỉ sau khoảng 17 giây. Trong trƣờng hợp phơi nhiễm Asen hoặc Cadmi thì ngƣợc lại, các “đầu dính” mất khả năng tái liên kết do đó có thể
xuất hiện các sai hình kiểu đứt gãy nhiễm sắc tử. Sự xuất hiện radical ở các đối tƣợng nhân viên chẩn đốn hình ảnh tại các bệnh viện rõ ràng là không tuân theo cơ chế phóng xạ cũng khơng thể giống kiểu nhiễm Asen hoặc Cadmi vì có tái liên kết “đầu dính” giữa các mảnh do tổn thƣơng SSB. Nhiều bằng chứng về tính độc di truyền của hóa chất trừ sâu lân hữu cơ, clo hữu cơ đã đƣợc cơng bố, có thể liên quan đến kết quả sai hình NST khảo sát đƣợc ở nhóm đối tƣợng nhóm đối tƣợng phát hiện năm 2000. Bên cạnh chỉ số đa tâm cung cấp giá trị phơng sai hình NST ngẫu nhiên cho công tác định liều sinh học theo nhiệm vụ của thành viên của WHO BioDoseNetworks, thì kết quả phân tích về tần số mảnh không tâm, đứt nhiễm sắc tử, MN và radical thu đƣợc là bằng chứng để đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng lên sức khỏe cộng đồng ở địa phƣơng nói riêng và thế giới nói chung.
3.3.NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỘC DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ HĨA CHẤT SỬ DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP DẠNG LÂN HỮU CƠ, CLO HỮU CƠ
3.3.1. Tính độc di truyền của Bini58 40EC (Dimethoate 95%).
3.3.1.1. Ảnh hưởng của Bini58 40EC đến chỉ số sai hình NST
Thuốc đƣợc pha lỗng trong mơi trƣờng ni cấy tế bào RPMI 1640 ở stock 10-2, phơi nhiễm tế bào lympho trong máu toàn phần ở các nồng độ 3.10-4, 6.10-4 và 10.10-4 bằng 2 cách: phơi nhiễm trƣớc nuôi cấy 180‟ và phơi nhiễm trong suốt thời gian nuôi cấy (phƣơng pháp nghiên cứu).
a. Đánh giá ảnh hƣởng của thuốc lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm: Chỉ số phân bào nguyên nhiễm đƣợc sử dụng để đánh giá chất lƣợng tiêu bản. Kết quả phân tích tiêu bản ở 7 nghiệm thức đều ở mức MI ≥2,5%,
Hầu hết các mẫu phơi nhiễm trong giới hạn nồng độ từ 3.10-4
– 10.10-4 đều có phổ sai hình rộng. Phân tích đã thu đƣợc hình ảnh metapha chứa các kiểu sai hình ở tất cả các nghiệm thức, một số hình ảnh điển hình sau:
1 mảnh, 1 đứt NS tử (6.10-4) Radical (10.10-4)
Hình 3.7. Các kiểu sai hình NSTbắt gặp ở các mẫuphơi nhiễm Bini58
Phổ sai hình gồm các kiểu xuất phát từ tổn thƣơng DSB nhƣ đa tâm, chuyển đoạn, mảnh không tâm và các kiểu xuất phát từ tổn thƣơng SSB nhƣ đứt nhiễm sắc tử và radical đều đƣợc phát hiện ở tế bào lympho phơi nhiễm Bini 58. Quan sát thấy kiểu sai hình radical ở mẫu phơi nhiễm thuốc nồng độ 10.10-4, sự xuất hiện kiểu sai hình này giống với kết quả thu đƣợc ở nhóm đối tƣợng nhân viên chẩn đốn hình ảnh và nhóm có mơi trƣờng đặc thù sử dụng các loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ, clo hữu cơ trong sản xuất trà, cà phê, dâu tằm. Sự xuất hiện radical ở tế bào lympho phơi nhiễm 180 phút cũng nhƣ 48 giờ chứng tỏ tổn thƣơng SSB gây ra đã không đƣợc phục hồi dẫn đến tái liên kết “đầu dính”.
c. Đánh giá định lƣợng các kiểu sai hình do tác động của Bini58:
Từ số liệu phân tích phụ lục 3.1, kết quả thống kê số liệu phân tích ở các mẫu phơi nhiễm thuốc đƣợc thể hiện ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Số liệu phân tích chỉ số sai hình NST ở các mẫu phơi nhiễm Bini 58 10-4 (B10-4). Nghiệm thức B 10-4 TG PN* Met. Đa tâm (%) Mảnh (%) Đứt NS tử (%) Radical (%) 1 0 0h 2969 0,03±0,06 0,13±0,06 0,14±0,06 - 2a 3 180‟ 2928 0,10±0,10 1,40±0,10 2,09±0,27 - 2b 3 48h 2907 0,14±0,06 2,47±0,24 3,32±0,76 - 3a 6 180‟ 2981 0,10±0,10 3,89±0,75 3,82±0,38 0,03±0,06 3b 6 48h 2872 0,28±0,11 4,05±0,46 5,27±0,41 - 4a 10 180‟ 2978 0,20±0,10 4,33±0,13 5,61±0,24 0,03±0,06 4b 10 48h 2878 0,18±0,07 5,04±0,62 6,78±0,29 0,29±0,15
* Thời gian phơi nhiễm.
Tần số các kiểu sai hình phân tích đƣợc ở mẫu đối chứng có đa tâm = 0,03 ± 0,06, mảnh không tâm = 0,13 ± 0,06 và đứt nhiễm sắc tử = 0,14 ± 0,06, các giá trị tần số ở cả 3 kiểu sai hình đều nằm trong vùng ngẫu nhiên. Bảng 3.14 cho thấy sự sai khác về tần số đa tâm, mảnh không tâm, đứt nhiễm sắc tử giữa các mẫu phơi nhiễm thuốc nồng độ khác nhau và giữa cách phơi nhiễm khác nhau trong cùng nồng độ. Về sai hình đa tâm, giá trị trung bình có sự khác nhau giữa các mẫu phơi nhiễm thuốc so với đối chứng, song ở mức độ khác nhau phụ thuộc vào nồng độ và cách phơi nhiễm. Tần số đa tâm mẫu phơi nhiễm 180‟ ở 2 nồng độ 3.10-4
và 6.10-4 tƣơng ứng 0,10 ± 0,10 và 0,10 ± 0,10 khơng có khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (đa tâm = 0,03 ± 0,06).
3b, 4a và 4b với đối chứng, df đều = 16. Kết quả đƣợc đánh giá với khoảng t vô hiệu ở xác suất 95% (a = 5%) từ -2.12 đến 2.12 đã chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tần số sai hình đa tâm ở các nghiệm thức phơi nhiễm 48 giờ (2b, 3b, 4b) cũng nhƣ ở liều phơi nhiễm cao (4a). Tần số sai hình mảnh khơng tâm và đứt nhiễm sắc tử có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê cao ở tất cả các nghiệm thức. Kết quả đƣợc biểu diễn trên hình 3.8.
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn sự liên quan giữa tần số các kiểu sai hình NST với nồng độ và cách phơi nhiễm Bini58
Giá trị t đã phản ánh hiệu quả của nồng độ thuốc và cách thức xử lý, theo đó các nghiệm thức xử lý trƣớc 180‟ cho hiệu quả tần số các kiểu sai hình thấp hơn các nghiệm thức xử lý 48 giờ.
Khảo sát số liệu ở trƣờng hợp phơi nhiễm 180‟ trƣớc nuôi cấy: Sự khác biệt đa tâm có ý nghĩa chỉ xảy ra với mẫu phơi nhiễm 10.10-4, mặc dù có giá trị trung bình cao hơn đối chứng khoảng 3 lần nhƣng kiểm định t-test khơng cho thấy có khác biệt có ý nghĩa giữa mẫu phơi nhiễm 3.10-4
và 6.10-4. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mẫu phơi nhiễm 3.10-4
, 6.10-4 và 10.10-4 đã đƣợc xác định đối với mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
fdi ffra fchb fra
1 2a 2b 3a 3b 4a 4b
+ Khảo sát số liệu ở trƣờng hợp phơi nhiễm suốt thời gian nuôi cấy: Giá trị trung bình của đa tâm, mảnh khơng tâm và đứt nhiễm sắc tử tăng theo liều thuốc phơi nhiễm. Sự khác biệt đa tâm có ý nghĩa so với đối chứng xảy ra ở cả 3 liều thuốc.
Tƣơng tự nhƣ vậy, sự khác biệt có ý nghĩa về mảnh không tâm, đứt nhiễm sắc tử cũng đƣợc khẳng định ở các mẫu phơi nhiễm 3.10-4
và 6.10-4. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mẫu phơi nhiễm 3.10-4
, 6.10-4 và 10.10-4 đƣợc xác định đối với mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử. Sai hình radical phát hiện ở mẫu phơi nhiễm suốt thời gian nuôi cấy ở nồng độ 10.10-4
là bằng chứng của hiện tƣợng khuyết phục hồi các tổn thƣơng SSB do Bini 58.
Kết quả kiểm định t-test giữa các cặp xử lý cùng liều nhƣng khác cách phơi nhiễm:
+ Cặp liều phơi nhiễm 3.10-4: Mặc dù tần số đa tâm, mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử ở thời gian phơi nhiễm toàn phần 48 giờ so với thời gian phơi nhiễm 180‟ song sự khác biệt có ý nghĩa chỉ xuất hiện ở số liệu mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử.
+ Cặp liều phơi nhiễm 6.10-4: Sự khác biệt có ý nghĩa đƣợc xác lập với cả đa tâm, mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử
+ Cặp liều phơi nhiễm 10.10-4: Tƣơng tự tình huống ở liều phơi nhiễm 3.10-4, tính khác biệt có ý nghĩa khơng đƣợc xác lập với đa tâm nhƣng đƣợc xác lập với mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử.
Rõ ràng là Bini 58 đã gây tổn thƣơng phân tử ADN, bản chất tính độc di truyền của Bini 58 là gây tổn thƣơng chuỗi ở cả 2 loại DSB và SSB ở các mức độ khác nhau phụ thuộc nồng độ phơi nhiễm. Sự xuất hiện các sai hình radical chứng tỏ các SSB đã không đƣợc phục hồi ngay dẫn đến sự tái liên kết cặp “đầu dính”.
3.3.1.2. Ảnh hưởng của Bini58 40EC đến chỉ số micronuclei.
Kỹ thuật micronuclei đọc tiêu bản ở kỳ cuối của chu trình tế bào đầu tiên do đó thời gian nuôi cấy tế bào đƣợc xác định là 72 giờ. Tác dụng của
Cytochalasin B là ngăn cản sự phân chia màng tế bào, do đó số nhân sau chu kỳ 1 là 2 nhân, sau chu kỳ 2 là 3 nhân hoặc 4 nhân.
Kỹ thuật tiêu bản đảm bảo giữ đƣợc màng tế bào, các tế bào giữ đƣợc màng sẽ giữ đƣợc micronuclei trong nguyên sinh chất bắt màu gemsa. Đánh giá ảnh hƣởng của Bini 58 đến chỉ số micronuclei ở tế bào lympho đƣợc thực hiện ở các nồng độ và thời gian phơi nhiễm khác nhau.
a. Đánh giá tỷ lệ tế bào hai nhân.
Bảng: 3.15. Kết quả tỷ lệ % tế bào 2 nhân ở các mẫu phơi nhiễm Bini 58
Nghiệm thức 1 2c 3c 3d 4c Tế bào 2 nhân (%) 34,82±1,45 38,71±0,8 35,78±2,57 19,82±0,57 32,94±4,84 Tế bào 4 nhân (%) 4,90±1,43 6,95±1,61 7,29±1,04 1,58±0,09 5,07±1,18
Kết quả từ nghiệm thức 3c và 3d cho thấy việc phơi nhiễm 72 giờ đã làm giảm phân chia tế bào so với phơi nhiễm 180‟. Nồng độ Bini 58 có ảnh hƣởng đến tỷ lệ tế bào 2 nhân.
b. Đánh giá khả năng phát sinh micronuclei.
Kết quả phân tích đã đƣa ra bằng chứng về sự hiện diện micronuclei ở tế bào 2 nhân, 4 nhân ở tất cả các mẫu phơi nhiễm Bini58.