Phổ sai hình gồm các kiểu xuất phát từ tổn thƣơng DSB nhƣ đa tâm, chuyển đoạn, mảnh không tâm và các kiểu xuất phát từ tổn thƣơng SSB nhƣ đứt nhiễm sắc tử và radical đều đƣợc phát hiện ở tế bào lympho phơi nhiễm Bini 58. Quan sát thấy kiểu sai hình radical ở mẫu phơi nhiễm thuốc nồng độ 10.10-4, sự xuất hiện kiểu sai hình này giống với kết quả thu đƣợc ở nhóm đối tƣợng nhân viên chẩn đốn hình ảnh và nhóm có mơi trƣờng đặc thù sử dụng các loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ, clo hữu cơ trong sản xuất trà, cà phê, dâu tằm. Sự xuất hiện radical ở tế bào lympho phơi nhiễm 180 phút cũng nhƣ 48 giờ chứng tỏ tổn thƣơng SSB gây ra đã không đƣợc phục hồi dẫn đến tái liên kết “đầu dính”.
c. Đánh giá định lƣợng các kiểu sai hình do tác động của Bini58:
Từ số liệu phân tích phụ lục 3.1, kết quả thống kê số liệu phân tích ở các mẫu phơi nhiễm thuốc đƣợc thể hiện ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Số liệu phân tích chỉ số sai hình NST ở các mẫu phơi nhiễm Bini 58 10-4 (B10-4). Nghiệm thức B 10-4 TG PN* Met. Đa tâm (%) Mảnh (%) Đứt NS tử (%) Radical (%) 1 0 0h 2969 0,03±0,06 0,13±0,06 0,14±0,06 - 2a 3 180‟ 2928 0,10±0,10 1,40±0,10 2,09±0,27 - 2b 3 48h 2907 0,14±0,06 2,47±0,24 3,32±0,76 - 3a 6 180‟ 2981 0,10±0,10 3,89±0,75 3,82±0,38 0,03±0,06 3b 6 48h 2872 0,28±0,11 4,05±0,46 5,27±0,41 - 4a 10 180‟ 2978 0,20±0,10 4,33±0,13 5,61±0,24 0,03±0,06 4b 10 48h 2878 0,18±0,07 5,04±0,62 6,78±0,29 0,29±0,15
* Thời gian phơi nhiễm.
Tần số các kiểu sai hình phân tích đƣợc ở mẫu đối chứng có đa tâm = 0,03 ± 0,06, mảnh không tâm = 0,13 ± 0,06 và đứt nhiễm sắc tử = 0,14 ± 0,06, các giá trị tần số ở cả 3 kiểu sai hình đều nằm trong vùng ngẫu nhiên. Bảng 3.14 cho thấy sự sai khác về tần số đa tâm, mảnh không tâm, đứt nhiễm sắc tử giữa các mẫu phơi nhiễm thuốc nồng độ khác nhau và giữa cách phơi nhiễm khác nhau trong cùng nồng độ. Về sai hình đa tâm, giá trị trung bình có sự khác nhau giữa các mẫu phơi nhiễm thuốc so với đối chứng, song ở mức độ khác nhau phụ thuộc vào nồng độ và cách phơi nhiễm. Tần số đa tâm mẫu phơi nhiễm 180‟ ở 2 nồng độ 3.10-4
và 6.10-4 tƣơng ứng 0,10 ± 0,10 và 0,10 ± 0,10 khơng có khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (đa tâm = 0,03 ± 0,06).
3b, 4a và 4b với đối chứng, df đều = 16. Kết quả đƣợc đánh giá với khoảng t vô hiệu ở xác suất 95% (a = 5%) từ -2.12 đến 2.12 đã chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tần số sai hình đa tâm ở các nghiệm thức phơi nhiễm 48 giờ (2b, 3b, 4b) cũng nhƣ ở liều phơi nhiễm cao (4a). Tần số sai hình mảnh khơng tâm và đứt nhiễm sắc tử có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê cao ở tất cả các nghiệm thức. Kết quả đƣợc biểu diễn trên hình 3.8.
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn sự liên quan giữa tần số các kiểu sai hình NST với nồng độ và cách phơi nhiễm Bini58
Giá trị t đã phản ánh hiệu quả của nồng độ thuốc và cách thức xử lý, theo đó các nghiệm thức xử lý trƣớc 180‟ cho hiệu quả tần số các kiểu sai hình thấp hơn các nghiệm thức xử lý 48 giờ.
Khảo sát số liệu ở trƣờng hợp phơi nhiễm 180‟ trƣớc nuôi cấy: Sự khác biệt đa tâm có ý nghĩa chỉ xảy ra với mẫu phơi nhiễm 10.10-4, mặc dù có giá trị trung bình cao hơn đối chứng khoảng 3 lần nhƣng kiểm định t-test khơng cho thấy có khác biệt có ý nghĩa giữa mẫu phơi nhiễm 3.10-4
và 6.10-4. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mẫu phơi nhiễm 3.10-4
, 6.10-4 và 10.10-4 đã đƣợc xác định đối với mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
fdi ffra fchb fra
1 2a 2b 3a 3b 4a 4b
+ Khảo sát số liệu ở trƣờng hợp phơi nhiễm suốt thời gian ni cấy: Giá trị trung bình của đa tâm, mảnh khơng tâm và đứt nhiễm sắc tử tăng theo liều thuốc phơi nhiễm. Sự khác biệt đa tâm có ý nghĩa so với đối chứng xảy ra ở cả 3 liều thuốc.
Tƣơng tự nhƣ vậy, sự khác biệt có ý nghĩa về mảnh không tâm, đứt nhiễm sắc tử cũng đƣợc khẳng định ở các mẫu phơi nhiễm 3.10-4
và 6.10-4. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mẫu phơi nhiễm 3.10-4
, 6.10-4 và 10.10-4 đƣợc xác định đối với mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử. Sai hình radical phát hiện ở mẫu phơi nhiễm suốt thời gian nuôi cấy ở nồng độ 10.10-4
là bằng chứng của hiện tƣợng khuyết phục hồi các tổn thƣơng SSB do Bini 58.
Kết quả kiểm định t-test giữa các cặp xử lý cùng liều nhƣng khác cách phơi nhiễm:
+ Cặp liều phơi nhiễm 3.10-4: Mặc dù tần số đa tâm, mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử ở thời gian phơi nhiễm toàn phần 48 giờ so với thời gian phơi nhiễm 180‟ song sự khác biệt có ý nghĩa chỉ xuất hiện ở số liệu mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử.
+ Cặp liều phơi nhiễm 6.10-4: Sự khác biệt có ý nghĩa đƣợc xác lập với cả đa tâm, mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử
+ Cặp liều phơi nhiễm 10.10-4: Tƣơng tự tình huống ở liều phơi nhiễm 3.10-4, tính khác biệt có ý nghĩa khơng đƣợc xác lập với đa tâm nhƣng đƣợc xác lập với mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử.
Rõ ràng là Bini 58 đã gây tổn thƣơng phân tử ADN, bản chất tính độc di truyền của Bini 58 là gây tổn thƣơng chuỗi ở cả 2 loại DSB và SSB ở các mức độ khác nhau phụ thuộc nồng độ phơi nhiễm. Sự xuất hiện các sai hình radical chứng tỏ các SSB đã khơng đƣợc phục hồi ngay dẫn đến sự tái liên kết cặp “đầu dính”.
3.3.1.2. Ảnh hưởng của Bini58 40EC đến chỉ số micronuclei.
Kỹ thuật micronuclei đọc tiêu bản ở kỳ cuối của chu trình tế bào đầu tiên do đó thời gian ni cấy tế bào đƣợc xác định là 72 giờ. Tác dụng của
Cytochalasin B là ngăn cản sự phân chia màng tế bào, do đó số nhân sau chu kỳ 1 là 2 nhân, sau chu kỳ 2 là 3 nhân hoặc 4 nhân.
Kỹ thuật tiêu bản đảm bảo giữ đƣợc màng tế bào, các tế bào giữ đƣợc màng sẽ giữ đƣợc micronuclei trong nguyên sinh chất bắt màu gemsa. Đánh giá ảnh hƣởng của Bini 58 đến chỉ số micronuclei ở tế bào lympho đƣợc thực hiện ở các nồng độ và thời gian phơi nhiễm khác nhau.
a. Đánh giá tỷ lệ tế bào hai nhân.
Bảng: 3.15. Kết quả tỷ lệ % tế bào 2 nhân ở các mẫu phơi nhiễm Bini 58
Nghiệm thức 1 2c 3c 3d 4c Tế bào 2 nhân (%) 34,82±1,45 38,71±0,8 35,78±2,57 19,82±0,57 32,94±4,84 Tế bào 4 nhân (%) 4,90±1,43 6,95±1,61 7,29±1,04 1,58±0,09 5,07±1,18
Kết quả từ nghiệm thức 3c và 3d cho thấy việc phơi nhiễm 72 giờ đã làm giảm phân chia tế bào so với phơi nhiễm 180‟. Nồng độ Bini 58 có ảnh hƣởng đến tỷ lệ tế bào 2 nhân.
b. Đánh giá khả năng phát sinh micronuclei.
Kết quả phân tích đã đƣa ra bằng chứng về sự hiện diện micronuclei ở tế bào 2 nhân, 4 nhân ở tất cả các mẫu phơi nhiễm Bini58.
Mono và binuclei. MN/ binuclei. 3MN/binuclei. MN/tetranuclei. Hình 3.9. Tế bào 2 nhân, 4 nhân ở các mẫu phơi nhiễm Bini 58.
Micronuclei là do các đơn vị nhiễm sắc khơng đính đƣợc vào thoi vơ sắc để đi về 2 cực tế bào, các đơn vị nhiễm sắc này thƣờng là các sai hình NST bất ổn định gồm đa tâm, mảnh không tâm, radical, chúng là hậu quả của các tổn thƣơng chuỗi phân tử ADN và quá trình tái liên kết cặp các mảnh có “đầu dính”. Bằng chứng micronuclei ở tất cả các mẫu phơi nhiễm Bini 58 chứng tỏ loại thuốc trừ sâu này gây tổn thƣơng chuỗi phân tử ADN.
Từ phụ lục 3.2, kết quả đánh giá định lƣợng micronuclei do tác động của Bini 58 đƣợc đƣa ra trong bảng 3.16.
Bảng 3.16. Số liệu phân tích micronuclei ở các mẫu phơi nhiễm Bini58.
Nghiệm thức B10-4 TG PN* MNb(%) MNt(%) 1 0 0 0,46 ± 0,34 0,86 ± 1,48 2c 3 180‟ 0,49±0,15 1,63±0,34 3c 6 180‟ 1,23±0,58 2,47±0,54 3d 6 72h 2,32±0,37 3,27±2,85 4c 10 180‟ 2,85±1,86 4,39±2,32
*. Thời gian phơi nhiễm; MNb: micronucei trong tế bào 2 nhân; MNt: micronuclei trong tế bào có 3 hoặc 4 nhân.
Giá trị MNt mang ý nghĩa bảo toàn micronuclei qua các lần phân chia, kết quả cho thấy tế bào trinuclei hoặc tetranuclei vẫn giữ micronuclei do màng tế bào không bị mất từ tế bào 1 nhân, mặc dù vậy MNt không đƣợc sử
dụng làm tham số định lƣợng.
Kết quả phân tích ở mẫu đối chứng cho MNb = 0,46 ± 0,34, giá trị này thấp hơn số liệu đƣợc khảo sát ở nhóm dân cƣ đặc thù mơi trƣờng sản xuất nông nghiệp và nằm trong vùng ngẫu nhiên so với các kết quả khảo sát trên Thế giới.
Kết quả so sánh giữa 2 cách phơi nhiễm với cùng nồng độ Bini 58 cho thấy ở mẫu phơi nhiễm 72h (mã thí nghiệm 3d) có MNb cao hơn mẫu phơi
nhiễm 180‟(mã thí nghiệm 3c) khoảng 2 lần. Mặc dù Bini 58 nồng độ 3.10-4
không làm tăng MNb rõ ràng so với đối chứng, nhƣng hiệu quả làm tăng tần
số MNb ở các nồng độ 6.10-4 và 10.10-4 thì rất rõ ràng.
Kết quả kiểm định t-test đƣợc tiến hành với số liệu tần số micronuclei ở tế bào 2 nhân (MNb) và ở tế bào 4 nhân (MNt) giữa mỗi nghiệm thức 2c, 3c, 3d, và 4c với đối chứng, df đều = 16. Kết quả đƣợc đánh giá với khoảng t vô hiệu ở xác suất 95% (a = 5%) từ -2.12 đến 2.12 đã chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tần số MNb phân tích ở các mẫu phơi nhiễm Bini58 so
với đối chứng. Sự khác nhau về tần số MNb cũng dễ dàng thấy đƣợc giữa các
liều phơi nhiễm khác nhau. Khả năng gây tổn thƣơng phân tử ADN dẫn đến micronuclei ở tế bào lympho phơi nhiễm Bini58 đã đƣợc khẳng định qua số liệu phân tích thu đƣợc.
3.3.2. Tính độc di truyền của Tasodant 600EC.
3.3.2.1. Ảnh hưởng của Tasodant 600EC đến chỉ số sai hình NST.
Tasodant 600EC đặc trị rệp sáp trên cà phê, có hoạt chất chlorpyrifos và permethrin là 2 loại hợp chất clo hữu cơ. Thuốc đƣợc pha lỗng trong mơi trƣờng nuôi cấy tế bào RPMI 1640 ở stock 10-2, phơi nhiễm tế bào lympho trong máu toàn phần ở các nồng độ 3.10-4
, 6.10-4 và 10.10-4 bằng 2 cách: phơi nhiễm trƣớc nuôi cấy 180‟ và phơi nhiễm trong suốt thời gian nuôi cấy.
Cả 3 loại thuốc Bini 58, Tasodant và Glyphosan đƣợc tiến hành cùng thời điểm với cùng mẫu máu do vậy có cùng đối chứng (nghiệm thức 1)
Kết quả đánh giá chất lƣợng tiêu bản cho thấy chỉ số phân bào nguyên nhiễm của tất cả các mẫu đều đạt MI ≥ 2,5%,đạt tiêu chuẩn phân tích sai hình NST.
b. Đánh giá các kiểu sai hình NST đƣợc phát hiện:
Giống với trƣờng hợp phơi nhiễm Bini 58, hầu hết các kiểu sai hình kiểu NST và kiểu nhiễm sắc tử đều đƣợc phát hiện ở các mẫu phơi nhiễm Tasodant.
Mảnh không tâm Radical dạng 4 cánh
Hình 3.10. Các kiểu sai hình NST ở các mẫuphơi nhiễm Tasodant
Cũng giống nhƣ hậu quả của việc phơi nhiễm Bini 58, các mẫu phơi nhiễm Tasodant cũng xuất hiện các kiểu sai hình NST do tổn thƣơng chuỗi phân tử ADN gồm DSB và SSB. Phổ sai hình gồm các kiểu xuất phát từ tổn thƣơng DSB nhƣ đa tâm, chuyển đoạn, mảnh không tâm và các kiểu xuất phát từ tổn thƣơng SSB nhƣ đứt nhiễm sắc tử và radical đều đƣợc phát hiện ở tế bào lympho phơi nhiễm Tasodant. Kiểu sai hình radical quan sát thấy ở mẫu phơi nhiễm Tasodant nồng độ 6.10-4
và 10.10-4, kiểu sai hình này giống với kết quả thu đƣợc ở nhóm đối tƣợng nhân viên chẩn đốn hình ảnh và nhóm có mơi trƣờng đặc thù sử dụng các loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ, clo hữu cơ trong sản xuất trà, cà phê, dâu tằm.
Kết quả phân tích sai hình NST đƣợc tổng kết trong bảng 3.17.
Bảng 3.17. Số liệu phân tích sai hình NST ở các mẫu phơi nhiễm Tasodant.
Nghiệm
thức T10
-4 TG PN*
Met. đa tâm% fra% chb% ra%
1 0 0 2969 0,03±0,06 0,13±0,06 0,14±0,06 - 5a 3 180‟ 2695 0,07±0,06 2,08±0,08 3,23±0,40 - 5b 3 48 2999 0,13±0,06 1,87±0,33 2,30±0,36 - 6a 6 180‟ 2943 0,10±0,10 2,89±0,32 3,67±0,45 0,03±0,06 6b 6 48 3008 0,13±0,06 2,86±0,15 3,29±0,17 - 7a 10 180‟ 2853 0,14±0,06 1,78±0,31 4,19±0,46 0,04±0,07 7b 10 48 2901 0,10±0,01 1,34±0,14 3,77±0,49 0,03±0,06
Cũng giống nhƣ các mẫu phơi nhiễm Bini 58, số liệu khảo sát ở các mẫu phơi nhiễm Tasodant cho thấy sự phụ thuộc giữa tần số sai hình đa tâm, mảnh khơng tâm, đứt nhiễm sắc tử với nồng độ thuốc. Kết quả kiểm định t- test đƣợc tiến hành với số liệu tần số sai hình đa tâm, mảnh khơng tâm và đứt nhiễm sắc tử giữa mỗi nghiệm thức 5a, 5b, 6a, 6b, 7a và 7b với đối chứng, df đều = 16. Đánh giá với khoảng t vô hiệu ở xác suất 95% (a = 5%) từ -2.12 đến 2.12 cho thấy hầu hết các giá trị t ở 6 nghiệm thức phơi nhiễm đều nằm ngồi khoảng vơ hiệu, kết quả phản ánh sự ảnh hƣởng của Tasodant đến khả năng gây tổn thƣơng ADN dẫn đến sai hình NST.
Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn sự liên quan giữa tần số các kiểusai hình NST với nồng độ và cách phơi nhiễm Tasodant.
Về sai hình đa tâm, kiểm định t khơng xác nhận sai lệch có ý nghĩa thống kê ở các trƣờng hợp phơi nhiễm nồng độ 3.10-4
/ 180‟ và 6.10-4/180‟, các kết quả cịn lại đều thể hiện có sự phụ thuộc đa tâm với nồng độ thuốc so với đối chứng. Trƣờng hợp phơi nhiễm 10.10-4/48h cũng là một ngoại lệ với đa tâm, mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử đều thấp hơn các giá trị tƣơng tự của trƣờng hợp phơi nhiễm 10.10-4
/ 180‟. Qui luật tăng đa tâm, mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử ở các mẫu còn lại đều tuân theo qui luật phụ thuộc nồng độ và phụ thuộc thời gian phơi nhiễm. Sự khác biệt có ý nghĩa về tần số mảnh không tâm và đứt nhiễm sắc tử đã xuất hiện ngay từ mẫu phơi nhiễm thuốc nồng độ 3.10-4
, tuy nhiên kết quả phân tích khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa thời gian phơi nhiễm 180‟ và thời gian phơi nhiễm 48h ở trƣờng hợp liều phơi nhiễm cao. Rõ ràng Tasodant đã gây tổn thƣơng ADN ở các mức độ khác nhau phụ thuộc nồng độ thuốc phơi nhiễm, Tasodant cũng gây cản trở phục hồi tổn thƣơng dẫn đến hình thành các sai hình có cơ chế tái liên kết “đầu dính” gồm kiểu đa tâm, chuyển đoạn và radical.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
fdi ffra fchb fra
1 5a 5b 6a 6b 7a 7b
3.3.2.2. Ảnh hưởng của Tasodant 600EC đến chỉ số micronuclei.
Khảo sát in vitro với Tasodant đƣợc tiến hành đồng thời với Bini 58 và Glypohosan nên có đối chứng là nghiệm thức 1.
a. Đánh giá chỉ số tế bào 2 nhân:
Tiêu bản đƣợc kiểm tra đạt chuẩn bằng cách xác định tỷ lệ % tế bào 2 nhân, kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.18. Đánh giá tế bào 2 nhân ở các mẫu phơi nhiễm Tasodan600EC.
Nghiệm thức 1 5c 6c 6d 7c Tế bào đơn nhân (%) 60,26±0,83 57,24±1,80 61,71±3,14 60,99±5,35 67,09±2,68 Tế bào 2 nhân(%) 34,83±1,46 36,66±3,55 34,80±2,30 39,01±5,35 30,55±3,32 Tế bào 4 nhân(%) 4,91±1,44 6,10±2,04 3,50±0,63 0,19±0,33 2,36±0,72
Tần số tế bào 2 nhân thấp nhất ở mẫu 7c, chứng tỏ nồng độ Tasodant không ảnh hƣởng đến khả năng phân chia tế bào và chất lƣợng tiêu bản.
b. Đánh giá khả năng phát sinh micronuclei:
Các tế bào 2 nhân và tế bào 4 nhân chứa micronuclei đã đƣợc nhận diện ở tất cả các mẫu phơi nhiễm Tasodant.
Binuclei. MN /binuclei. MN / binuclei MN/trinuclei
Kết quả phân tích micronuclei đƣợc đƣa ra trong bảng 3.19.
Bảng 3.19. Số liệu phân tích micronuclei do phơi nhiễm Tasodant
Nghiệm thức T10-4 TGPN* MNb% MNt% 1 0 0 0,46±0,34 0,86 ±1,48 5c 3 180‟ 1,10±0,85 3,60±1,06 6c 6 180‟ 1,84±0,50 5,19 ±2,75 6d 6 72h 2,31±0,93 - 7c 10 180‟ 2,83±1,14 4,52 ±4,10
Sự vắng mặt MNt ở các mẫu phơi nhiễm Tasodant 6.10-4 / 72h là do tần số tế bào cuối chu kỳ 2 (4 nhân và 3 nhân) rất thấp. Kết quả so sánh giữa 2 cách phơi nhiễm 180‟ (6c) và 72h (6d) cho thấy tần số micronuclei tăng khoảng 1,5 lần ở tế bào 2 nhân.
Kết quả kiểm định t-test đƣợc tiến hành với số liệu tần số micronuclei ở