(*. fx: di; fra; chb và ra).
Bini58 40EC Tasodant 600EC Glyphosan Hình 3.15. Biểu đồ so sánh tần số MN với nồng độ và
cách phơi nhiễm thuốc.
Kết quả phân tích đã chỉ ra sự khác biệt về khả năng gây độc di truyền của 3 loại hóa chất thử nghiệm: Bini58, Tasodant và Glyphosan. Sai hình
0 1 2 3 4 5 6 7 8
fdi ffra fchb fra 1 2a 2b 3a 3b 4a 4b 0 1 2 3 4 5 1 5a 5b 6a 6b 7a 0 0.1 0.2 0.3 fd i ff ra fc h b fra 1 8a 8b 9a 9b 10a 10b 0 1 2 3 4 5 1 2c 3c 3d 4c fmnb fmnt 0 1 2 3 4 5 6 1 5c 6c 6d 7c fmnb fmnt 0 1 2 3 4 1 8c 9c 9d 10c fmnb fmnt
NST với tần số khác biệt rõ ràng so với đối chứng đã đƣợc phát hiện ở các mẫu phơi nhiễm thuốc trừ sâu Bini58 và Tasodant trong khi đó khơng đƣợc ghi nhận ở kết quả phân tích với Glyphosan. Giá trị tuyệt đối trên trục fx của
đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thuốc cho thấy tăng khoảng 8 lần đối với Bini 58, khoảng 5 lần đối với Tasodant và khoảng 3 lần đối với Glyphosan, điều đó phản ánh mức độ gây tổn thƣơng DSB, SSB khác nhau của mỗi loại hóa chất thử nghiệm (hình 3.15).
Kiểm định t-test với t = 1,98 (p = 95%) khơng cho thấy khác biệt có ý nghĩa về đa tâm, mảnh không tâm, đứt nhiễm sắc tử giữa các mẫu phơi nhiễm Glyphosan so với đối chứng, trong khi kết quả ngƣợc lại thu đƣợc đối với mẫu phơi nhiễm Bini58 cũng nhƣ Tasodant.Tƣơng tự kết quả nhƣ vậy cũng đƣợc ghi nhận với chỉ số micronuclei, trong khi MN ở các mẫu phơi nhiễm Bini 58 hoặc Tasodant là khoảng 3% thì ở các mẫu phơi nhiễm Glyphosan chỉ ở mức khoảng 1,2% (hình 3.16).
Kết quả đánh giá kiểu sai hình và định lƣợng chứng tỏ có ảnh hƣởng của nồng độ và cách phơi nhiễm Bini58 cũng nhƣ Tasodant, theo đó chúng gây nên các tổn thƣơng chuỗi DSB và SSB. Kết quả này phù hợp với công bố của Gunther 1965, 1973 và nhiều cơng trình nghiên cứu khác, phân tử Dimethoat, Methidathion có trong các loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ liên kết với phân tử ADN của NST, quá trình khuyết phục hồi hoặc phục hồi nhầm các liên kết đó đã tạo nên các tổn thƣơng phân tử ADN dạng DSB, SSB gián tiếp.
Công bố của Preussmann, 1969, Bedford and Robinson, 1972, Wooder and Wright, 1981 chỉ ra rằng các thuốc trừ sâu lân hữu cơ đều là các chất alkyl hóa, thƣờng tác động đến các nguyên tử Nitơ, Oxy và nhóm phosphat của Adenine, Guanine và Cytosine. Trong khi tổn thƣơng DSB chỉ đƣợc phục hồi theo xác suất tái hợp “đầu dính” thì tổn thƣơng SSB thƣờng đƣợc phục hồi ngay theo nguyên tắc tái bản bổ sung nucleotit, do vậy sai hình Radical là
một dạng riêng biệt. Sự xuất hiện radical chứng tỏ Bini58 và Tasodant không những gây tổn thƣơng chuỗi mà còn ngăn cản sự phục hồi của các tổn thƣơng SSB. Phổ sai hình, đặc biệt là các kiểu radical đƣợc phát hiện ở các mẫu phơi nhiễm Bini 58 và Tasodant giống với phổ sai hình phát hiện đƣợc ở nhóm đối tƣợng dân cƣ đặc thù môi trƣờng sử dụng các loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ, clo hữu cơ trong sản xuất trà, cà phê, dâu tằm.
Kết quả phát hiện tính độc di truyền của các loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ và clo hữu cơ in vitro trên hệ tế bào lympho máu ngoại vi ngƣời một lần nữa giải thích các phát hiện về sự liên quan giữa sai hình NST ở các đối tƣợng liên quan thuốc trừ sâu của Trịnh Văn Bảo 1974, De Ferrari 1991, Garaj 2001, Lander và Lucero 2000, Susana 2003. Bằng chứng sai hình NST ở tế bào lympho máu ngoại vi ở nhóm dân cƣ tiếp xúc thuốc trừ sâu lân hữu cơ, clo hữu cơ và các nghiên cứu in vitro trên hệ tế bào lympho máu ngoại vi ngƣời là bằng chứng để WHO khuyến cáo cấm hoặc hạn chế sử dụng các loại hóa chất này trong nơng nghiệp.
3.4. NGHIÊN CỨU GIẢI PHÁP PHƠI NHIỄM KÉP ĐỂ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỘC DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT KIM LOẠI NẶNG TÍCH LŨY SINH HỌC BỀN.
Cơ sở của giải pháp phơi nhiễm kép với bức xạ gamma là sử dụng bức xạ gamma nhƣ một yếu tố kép có cơ chế gây tổn thƣơng phân tử ADN rõ ràng, các yếu tố cần đánh giá tính độc di truyền đƣợc coi là yếu tố thử nghiệm.
Bức xạ gamma có cơ chế gây tổn thƣơng phân tử ADN ở dạng các tổn thƣơng chuỗi đôi và các tổn thƣơng chuỗi đơn có khả năng hình thành các kiểu sai hình NST, sai hình nhiễm sắc tử, nhƣ vậy yếu tố thử nghiệm đƣợc đánh giá qua sự chi phối định lƣợng các kiểu sai hình.
Tính độc di truyền tế bào của các yếu tố thử nghiệm đƣợc phát hiện theo 3 khả năng: thêm tổn thƣơng phân tử ADN, chỉ ngăn cản tái liên kết “đầu dính”, cùng có cả 2 trƣờng hợp. Với sự có mặt của yếu tố gây độc di truyền tế bào thì sự “nhiễu” sẽ xảy ra khi có yếu tố độc hại thứ 2 làm tăng tổn thƣơng phân tử ADN hoặc ngăn cản tái liên kết cặp “đầu dính”. Dựa vào tần số sai hình NST ở cùng liều phóng xạ có thể xác định đƣợc bản chất tính độc di truyền của yếu tố thử nghiệm.
3.4.1. Khảo sát tính độc di truyền của Asen.
3.4.1.1.Kết quả khảo sát sai hình NSTở tế bào lympho máu tồn phần phơi nhiễm đơnAsen.
a. Đánh giá ảnh hƣởng của Asen lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm: Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhằm đánh giá khả năng gây độc tế bào của As2O3 ở các liều phơi nhiễm (nồng độ As3+) từ 0,025 µg /ml đến 0,150
µg /ml. Chỉ số mitose (MI) đƣợc sử dụng để đánh giá kết quả. Kết quả khảo sát có trên bảng 3.23.
Bảng 3.23. Kết quả phân tích chỉ số phân bào nguyên nhiễm ở tế bào lympho ni cấy máu tồn phần phơi nhiễm Asen.
Nghiệm thức Nồng độ As3+ (µg/ml) Tổng số tế bào Tế bào phân chia MI 1 0 3034 92 3,03 ± 0,17 2 0,025 3025 83 2,74 ± 0,11 3 0,050 2991 63 2,11 ± 0,09 4 0,100 2996 37 1,23 ± 0,20 5 0,150 3002 28 0,93 ± 0,30
Tiêu bản đối chứng có MI = 3,03 ± 0,17, nằm trong giới hạn chuẩn nuôi cấy tế bào lympho. Kết quả cho thấy Asen gây ảnh hƣởng lớn đến phân chia tế bào, MI giảm dần theo nồng độ phơi nhiễm từ 0,025 µg/ml đến 0,150 µg/ml. Kiểm định t (t-test) với df (bậc tự do) = n1 + n2 – 2, giá trị t tính theo cơng thức t = (X1 – X2) / [(S12 /n1) + (S22 /n2)]1/2 đối với số liệu thu đƣợc ở các nghiệm thức phơi nhiễm As2O3 trên bảng 3.23. Kết quả kiểm định t (t-test) đƣợc tiến hành với số liệu chỉ số phân bào nguyên nhiễm (MI) giữa mỗi nghiệm thức 2, 3, 4 và 5 với đối chứng, df đều = 16. Khoảng t vô hiệu ở xác suất 95% (α = 5%) từ -2.12 đến 2.12, nhƣ vậy giá trị t ở các cặp kiểm định đều nằm ngồi vùng vơ hiệu chứng tỏ có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. MI giảm đáng kể ngay ở nồng độ phơi nhiễm 0,025µg/ml, với nồng độ phơi nhiễm 0,10 µg/ml làm giảm chỉ số phân bào MI khoảng 3 lần. Kết quả này đồng thuận với khuyến cáo giảm nồng độ Asen cho phép đối với môi trƣờng so với tiêu chuẩn hiện nay đƣợc công bố bởi WHO. Nồng độ gây chết tế bào 50% nằm trong khoảng 0,05 – 0,10 µg/ml, nhƣ vậy các nồng độ ≤ 0,10 µg/ml đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu phơi nhiễm kép.
c. Đánh giá ảnh hƣởng của Asen lên chỉ số sai hình NST.
Bảng 3.24. Số liệu phân tích sai hình NST ở tế bào lympho ni cấy máu toàn phần phơi nhiễm As3+
Nghiệm thức Nồng độ As3+ (µg/ml) TG PN* Tổng metapha Đa tâm (%) Mảnh (%) Đứt NS tử (%) 1 0 0 2971 0,07±0,06 0,17±0,06 0,11±0,06 2 0,025 180‟ 2992 0,05±0,07 0,17±0,06 0,10±0,10 3 0,05 48 11456 0,07±0,06 0,15±0,14 0,20±0,19 4 0,10 180‟ 2982 0,03±0,06 0,27±0,12 0,10±0,10 5 0,15 48 1375 0,08±0,15 0,29±0,11 0,37±0,16
Đối với kiểu sai hình đa tâm, giá trị di ở các mẫu phơi nhiễm Asen đều không vƣợt quá giá trị ngẫu nhiên 1/1000. Kết quả kiểm định t (t-test) đƣợc tiến hành với số liệu tần số sai hình đa tâm, mảnh khơng tâm và đứt nhiễm sắc tử giữa mỗi nghiệm thức 2, 3, 4 và 5 với đối chứng trên bảng 3.24, df đều = 16. Kết quả đƣợc đánh giá với khoảng t vô hiệu ở xác suất 95% (α = 5%) từ -2.12 đến 2.12. Kết quả khơng chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về kiểu sai hình đa tâm ở tất cả các nồng độ phơi nhiễm As2O3. Đối với
kiểu sai hình mảnh khơng tâm, giá trị mảnh không tâm đều không vƣợt ngƣỡng 2/1000 ở các mẫu 2 và 3. Các giá trị mảnh không tâm ở mẫu 4 và 5 cao hơn đối chứng khoảng 1,5 lần và có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. Ngoài trƣờng hợp tăng rõ ràng ở nghiệm thức 5, kiểu sai hình tổn thƣơng nhiễm sắc tử đều khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng ở các nghiệm thức còn lại. Kết quả thu đƣợc phù hợp với Jha 1992, Flessel 1997, Hartwig 1997, Danae 2004, Chen 2005 và Chunyan
2005 rằng Asen không phải là yếu tố gây tổn thƣơng phân tử ADN dẫn đến sai hình NST một cách rõ ràng.
3.4.1.2. Kết quả khảo sát micronuclei ở tế bào lympho máu toàn phần phơi nhiễm đơn Asen. phơi nhiễm đơn Asen.
a. Đánh giá ảnh hƣởng của Asen lên chỉ số tế bào 2 nhân.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành với việc phơi nhiễm tế bào lympho máu tồn phần bởi Asen bằng 2 cách trƣớc ni cấy 180‟ và đồng thời nuôi cấy với các nồng độ 0,05; 0,10 và 0,15 µg/ml. Sử dụng kỹ thuật micronuclei với cytochalasin B nhằm ngăn cản phân chia màng tế bào sau kỳ cuối, nhƣ vậy sau kỳ cuối của chu kỳ thứ nhất tế bào sẽ có 2 nhân, sau kỳ cuối chu kỳ thứ 2 sẽ có 4 nhân hoặc 3 nhân. Các tế bào 2 nhân, 4 nhân, 3 nhân chính là các tế bào phân chia, các tế bào đơn nhân mononuclei là các tế bào không phân chia. Kết quả phân tích đƣợc thống kê trênbảng 3.25.
Bảng 3.25. Số liệu phân tích ảnh hưởng của Asen đến binuclei ở các nồng độ phơi nhiễm khác nhau.
Nghiệm thức Nồng độ As3+ (µg/ml) TGPN* Tổng số tế bào Tế bào 2 nhân (%) Tế bào 4 nhân (%) 1 0 0 1890 30,34±2,64 1,87 ±0,45 2c 0,05 180‟ 2282 30,15±3,52 1,84 ±0,24 2d 0,05 72h 2264 28,42±2,92 1,59±0,35 3c 0,10 180‟ 2128 28,54 ±2,65 1,14 ±0,40 3d 0,10 72h 2104 29,68 ±2,07 1,27±0,31 4d 0,15 72h 6496 15,35±0,44 1,10±0,32
Mẫu đối chứng có tần số tế bào 2 nhân = 30,34 ± 2,64, đạt mức chuẩn đối với kỹ thuật micronuclei của TCCS-VNCHN và IAEA.
Tần số tế bào 2 nhân ở các nồng độ 0,05 và 0,10µg/ml khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. Với giá trị tbinu = 16,803 đã xác
định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tần số tế bào 2 nhân so với đối chứng ở mẫu phơi nhiễm nồng độ 0,15 µg/ml / 72 giờ.
b.Đánh giá ảnh hƣởng của Asen lên chỉ số micronuclei.
Các sai hình NST bất ổn định sẽ tạo nên micronuclei trong tế bào 2 nhân hoặc bốn nhân. Số lƣợng micronuclei trong tế bào 2 nhân chính là các sai hình NST bất ổn định do tổn thƣơng phân tử ADN ở pha G1, là tham số định lƣợng.
Kết quả phân tích chỉ số micronuclei có trong bảng 3.26.
Bảng 3.26. Số liệu phân tích micronuclei ở tế bào lympho trong ni cấy máu tồn phần phơi nhiễm Asen.
Nghiệm thức Nồng đơ As3+ (µg/ml) TGPN* Ʃtế bào MNb% MNt% 1 0 0 1890 0,53±0,12 0,37±0,19 2c 0,05 180‟ 2282 0,53±0,26 0,31±0,06 2d 0,05 72h 2264 0,49±0,18 0,44±0,16 3c 0,10 180‟ 2128 0,78±0,26 0,38±0,05 3d 0,10 72h 2104 0,80±0,19 0,52±0,07 4d 0,15 72h 6496 0,37±0,2 0,15±0,15
Kết quả cho thấy tần số MNb khơng thay đổi nhiều theo hình thức phơi nhiễm (so sánh nghiệm thức 2c với 2d; 3c với 3d). Kết quả MNb có tăng nhẹ
theo nồng độ phơi nhiễm Asen. Kết quả kiểm định t-test đƣợc tiến hành với số liệu tần số micronuclei ở tế bào 2 nhân (MNb) và ở tế bào 4 nhân (MNt) giữa mỗi nghiệm thức 2c, 2d, 3c, 3d và 4d với đối chứng, đều có df = 16 với khoảng t vô hiệu ở xác suất 95% (a = 5%) đƣợc xác định từ -2.12 đến 2.12. Giá trị t >0 biểu hiện số liệu so sánh lớn hơn đối chứng và ngƣợc lại, nhƣ vậy chỉ có tần số MNb ở nghiệm thức 3c, 3d là tăng có ý nghĩa thống kê so với đối chứng.
Sự giảm MNb ở liều 0,15 µg/ml có thể do sự ảnh hƣởng của Asen đến phân bào ở nồng độ này quá cao. Giá trị MNb thu đƣợc trên bảng 3.26 phù hợp với kết quả phân tích sai hình NST ở bảng 3.32, khẳng định Asen gây ra sự khác biệt không lớn ở các nồng độ phơi nhiễm khác nhau.
3.4.1.3. Kết quả khảo sát sai hình NST ở tế bào lympho máu toàn phần phơi nhiễm kép Asen / bức xạ gamma. phơi nhiễm kép Asen / bức xạ gamma.
Số liệu phân tích đƣợc tiến hành với từng mẫu trong bảng thiết kế 2.3 (phƣơng pháp nghiên cứu), bảng có 15 điểm là các nghiệm thức đƣợc phối
hợp giữa 2 nồng độ Asen và 2 liều gamma khác nhau (điểm 10 trùng với kiểu 2, điểm 11 trùng điểm 3).
Các nghiệm thức từ 1 đến 9 đƣợc phơi nhiễm As2O3 trƣớc rồi chiếu xạ sau, từ 12 đến 15 đƣợc chiếu phóng xạ trƣớc rồi phơi nhiễm As2O3 sau. Kết quả phân tích so sánh đƣợc thực hiện trong nhóm cùng liều phóng xạ: 4, 5, 6, 12 và 13; 7, 8, 9, 14 và 15 nhằm xác định ảnh hƣởng của nồng độ Asen và ảnh hƣởng của cách phơi nhiễm trƣớc và sau chiếu xạ đến tần số các kiểu sai hình NST kiểu đa tâm và mảnh khơng tâm.
Số liệu phân tích đƣợc đánh giá theo phƣơng pháp kiểm định t (t-test) nhằm đánh giá tính khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng trong nhóm cùng liều phóng xạ qua đó đánh giá vai trị gây độc di truyền của As2O3.
a. Đánh giá ảnh hƣởng của phơi nhiễm kép Asen/ gamma lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm.
Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của Asen kết hợp với chiếu xạ gamma đến chỉ số phân bào nguyên nhiễm có trong bảng 3.27.
Bảng 3.27. Số liệu phân tích chỉ số phân bào nguyên nhiễm ở các điểm phối hợp phơi nhiễm kép As3+
/ bức xạ gamma Cách phơi nhiễm Nghiệm thức Liều
phối hợp Ʃtế bào Tế bào
phân chia MI As 180‟ / gamma 1 0/0 2134 67 3,36 ± 0,41 2 0,05/0 1038 33 3,27 ± 0,39 3 0,10/0 1679 19 1,16 ± 0,15 4 0/0,5 1249 38 3,12 ± 0,37 5 0,05/0,5 1575 29 1,83 ± 0,14 6 0,10/0,5 2511 21 1,72 ± 0,15 7 0/1,0 1909 33 2,33 ± 0,23
8 0,05/1,0 1546 16 1,57 ± 0,15 9 0,10/1,0 1106 21 1,21 ± 0,14 Gamma 60‟ / As 10(2) 0,05/0 1038 33 3,27 ± 0,39 11(3) 0,10/0 1679 19 1,16 ± 0,15 12 0,05/0,5 1588 45 2,76 ± 0,28 13 0,10/0,5 1317 17 1,33 ± 0,14 14 0,05/1,0 1534 27 1,82 ± 0,16 15 0,10/1,0 1485 20 1,45 ± 0,13
Xét về ảnh hƣởng của liều phóng xạ, số liệu phân tích ở các nhóm nghiệm thức cùng nồng độ phơi nhiễm As2O3gồm 1, 4 và 7 (As = 0); 2, 5 và 8 (As = 0,05 µg/ml); 3, 6 và 9 (As = 0,10 µg/ml) cho thấy liều phóng xạ làm giảm MI ở mức độ khơng rõ ràng. Xét về ảnh hƣởng của As2O3, ở các nhóm cùng liều phóng xạ gồm: 1, 2 và 3; 4, 5 và 6; 7, 8 và 9 cho thấy nồng độ As2O3 làm giảm MI ở mức độ cao. Xét theo cách thức phơi nhiễm theo
các cặp phơi nhiễm As2O3 trƣớc và phơi nhiễm sau chiếu xạ gồm các cặp
cùng liều: 5 với 12; 6 với 13; 8 với 14; 9 với 15 cho thấy MI thấp hơn ở các trƣờng hợp phơi nhiễm As2O3 trƣớc chiếu xạ. Kết quả cho thấy mặc dù cùng khuynh hƣớng ảnh hƣởng đến MI nhƣng phóng xạ có mức độ thấp hơn As2O3, tác động của As2O3 đến MI ở phơi nhiễm trƣớc cao hơn ở phơi
nhiễm sau.
b. Đánh giá ảnh hƣởng của phơi nhiễm kép Asen/ gamma lên kiểu sai hình NST:
Kết quả ở các mẫu phơi nhiễm kép có phổ phân loại hồn tồn giống với các mẫu chỉ chiếu xạ, đó là các kiểu sai hình đa tâm, mảnh khơng tâm. Hình ảnh các metapha có sai hình NST từ các mẫu phơi nhiễm Asen/gamma nhƣ sau:
Metapha có 1 sai hình 3 tâm, 1 sai hình 2 tâm, 3 mảnh (46 đv)
Metapha có 1 vịng có tâm và 1 mảnh (47 đv)
Hình 3.16. Sai hình do phối hợp phơi nhiễm kép As3+ / bức xạ gamma