Chương 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4 Bố trí thí nghiệm
3.4.2.1 Khảo sát thành phần bưởi Năm Roi
Khảo sát thành phần bưởi Năm Roi
Lên men chính với
Saccharomyces cerevisae F28 tự
do - Tối ưu các thông số lên men Khảo sát đặc điểm của
Saccharomyces cerevisae F28
Phân tích đánh giá sơ bộ chất lượng sản phẩm
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống
Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix
Khảo sát thời gian lên men chính
Khảo sát độ pha loãng của dịch bưởi
Khảo sát ảnh hưởng của pH
Nhằm xác định một số các thông số kỹ thuật trong q trình lên men rượu bưởi, chúng tơi tiến hành xác định một số chỉ tiêu của bưởi như sau:
Xác định pH: bằng máy đo pH
Xác định hàm lượng đường khử-đường tổng
Xác định hàm lượng acid tổng (tính theo acid citric): dùng dung dịch kiềm chuẩn NaOH/KOH và chỉ thị phenolphtalein
Xác định hàm lượng vitamin C: theo AOAC 2002.
3.4.2.2 Thí nghiệm khảo sát đặc điểm sinh học của Saccharomyces ceverisae F28
Tiến hành trải đĩa để kiểm tra tính thuần của giống, nhuộm tế bào để quan sát hình thái nấm men.
3.4.2.3 Các thí nghiệm tối ưu mơi trường lên men
Thí nghiệm 1: Khảo sát độ pha lỗng của dịch bưởi sau khi ép
Dịch bưởi Lọc Pha lỗng 1:0 1:1 1:2 1:3 1:4
Kiểm tra các thơng số: độ Brix, pH, đường tổng, acid tổng, cảm quan
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng lên men của dịch rượu bưởi Giống Saccharomyces cerevisae F28 Nhân giống cấp 1 Dịch bưởi Nhân giống cấp 2 Lên men Phối chế (pH=4,5; 0Bx=20, Na2SO3 50mg/l dịch bưởi)
Kiểm tra các thông số:
0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, độ rượu theo thời gian theo dõi Pha lỗng theo thí nghiệm (1)
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất khơ hịa tan đến khả năng lên men rượu bưởi
Giống Saccharomyces
cerevisae F28
Nhân giống cấp 1
Dịch bưởi
Nhân giống cấp 2
Bổ sung Na2SO3 50mg/l dịch bưởi Khảo sát ở 4 giá trị pH: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0
Kiểm tra các thông số:
0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, độ rượu ứng với 4 giá trị pH Chỉnh 0Bx=20
Lọc, pha lỗng theo thí nghiệm (1)
Lên men chính với thời gian được xác định ở thí nghiệm (2) Bổ sung
10%
Đường Saccharose
Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống bổ sung vào trước khi lên men rượu bưởi
Giống Saccharomyces
cerevisae F28
Nhân giống cấp 1
Dịch bưởi
Nhân giống cấp 2
Bổ sung Na2SO3 50mg/l dịch bưởi Điều chỉnh pH về giá trị được xác định ở thí
nghiệm (3)
Kiểm tra các thơng số:
0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, độ rượu ứng với 4 giá trị 0Bx Khảo sát 0Bx ở các giá trị:
18; 20; 22; 24
Lọc, pha lỗng theo thí nghiệm (1)
Lên men chính với thời gian được xác định ở thí nghiệm (2) Bổ sung
10%
Đường Saccharose
3.4.2.4 Lên men tối ưuGiống Saccharomyces Giống Saccharomyces cerevisae F28 Nhân giống cấp 1 Dịch bưởi Nhân giống cấp 2
Bổ sung Na2SO3 50mg/l dịch bưởi
Điều chỉnh pH về giá trị được xác định trong thí nghiệm (3)
Kiểm tra các thông số:
0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, độ rượu ứng với 4 tỷ lệ giống khảo sát Chỉnh 0Bx về giá trị thí ngiệm (4)
Lọc, pha lỗng theo thí nghiệm (1)
Lên men chính với thời gian được xác định ở thí nghiệm (2)
Đường Saccharose
5% 7% 10% 12%
3.5 Các phương pháp nghiên cứu3.5.1 Phương pháp vi sinh 3.5.1 Phương pháp vi sinh Giống Saccharomyces cerevisae F28 Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2
Lên men chính theo thời gian tối ưu
Điều chỉnh về pH tối ưu Pha loãng theo độ pha loãng
tối ưu Lọc
Bổ sung dd Na2SO3 theo tỷ lệ 50mg/l dịch bưởi
Điều chỉnh về 0Bx tối ưu
Rượu bưởi Bổ sung tỷ lệ tối ưu
3.5.1.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc phát triển trên mơi trường thạch
Ngun tắc: cấy chính xác một thể tích mẫu (hoặc dịch pha lỗng) lên trên bề mặt môi trường thạch. Từ mỗi độ pha lỗng lấy lặp lại ít nhất là 2 hộp và mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha lỗng liên tiếp để làm sao trên mỗi hộp có từ 30 đến 300 khuẩn lạc. Ni cấy trong điều kiện thích hợp cho các vi sinh vật phát triển, sau đó đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch.
Ta tiến hành như sau:
Đầu tiên chuẩn bị mơi trường thích hợp và dịch pha lỗng, sau đó khử trùng cùng với các dụng cụ cần dùng, pha lỗng mẫu đến nồng độ cần thiết. Sau đó cấy mẫu trên mơi trường thạch: rót khoảng 15-18ml mơi trường sau khi hấp khử trùng để nguội 450 vào mỗi đĩa Petri đã vơ trùng. Sau đó để thạch nguội đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 2-3 ngày để kiểm tra độ vô trùng của chúng.
Đưa một cách vơ trùng một thể tích 0,05-0,1ml mẫu đã pha lỗng đến nồng độ cần thiết lên bề mặt thạch. Dùng que trang vô trùng dàn đều thể tích này lên khắp bề mặt mội trường. Lật hộp lại và đem ủ trong tủ ủ ở 320C trong 48h, sau đó tiến hành đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa [8].
Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml mẫu được tính theo cơng thức:
v f n n C N × × + = ∑ 1 2 1 0,1 ) ( Trong đó:
N- số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu
∑C- tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n1- số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất
n2- số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ hai
f1- hệ số pha loãng của đĩa ở nồng độ pha loãng thứ nhất v- thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa Petri
Tế bào nấm men có kích thước tng đối lớn nên có thể đếm trực tiếp số tế bào bằng buồng đếm hồng cầu.
Cấu tạo buồng đếm hồng cầu: buồng đếm là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phần lõm phẳng có kẽ một lưới gồm 400 ơ vng có diện tích tổng cộng là 1mm2. Ơ vng trung tâm được khoanh trịn gồm 25 ơ, trong mỗi ơ có 16 ơ nhỏ, chiều sâu mỗi ơ nhỏ là 0.1mm, diện tích một ơ là 0.0025mm2. Khi đếm ta có thể đếm ở 5 ơ vng theo đường chéo hoặc 4 ơ ở 4 góc và ơ trung tâm [8].
Mật độ tế bào được tính theo cơng thức sau:
Số tế bào đếm được × độ pha lỗng 0,0025×0,1×16×5×10−3
Trong đó:
0,0025: Diện tích 1 ơ nhỏ 0,1: Chiều sâu của một ô nhỏ 16: Số ô nhỏ trong 1 ô lớn
5: Số ô lớn được đếm trong ô trung tâm 10-3: Đổi từ mm3 sang ml.
3.5.2 Phương pháp hóa sinh
3.5.2.1 Phương pháp định lượng đường tổng
Pha dung dịch saccharose 0,1% ( cân 500mg saccharose, sấy khơ ở 600C hịa tan trong 500ml nước cất)
Pha các dung dịch đường với hàm lượng khác nhau: lấy 7 bình định mức 100ml rồi cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch saccharose 0,1% ở trên, cho nước cất tới vạch mức.
Pha phelnol 5%: cân 5g phenol trong 100ml nước cất.
Hút từ 7 dung dịch đường đã pha ở trên mỗi dung dịch 1ml cho vào ống nghiệm, lấy 1ml dung dịch phenol 5% và 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, để phản ứng trong 10 phút rồi lắc, để cách thủy 10-20 phút ở 25-300C, khi màu bền trong vài giờ thì tiến hành đi đo OD ở bước sóng 490nm. Ta dựng được đồ thị chuẩn, làm tương tự với mẫu cần xác định đường tổng ta sẽ xác định được giá trị đường tổng [8].
3.5.2.2 Phương pháp đo độ cồn
Dùng bình tỷ trọng:
Đầu tiên rửa sạch bình tỷ trọng, sấy khọ và làm lạnh trong bình hút ẩm, sau đó đem cân bình khơng ta được m1 gam.
Tiếp theo rót nước cất vào bình đến trên ngấn định mức, đặt bình vào nồi cách thủy có nhiệt độ 200C. Sau 15 phút dùng giấy lọc thấm nước tới ngấn bình đồng thời thấm khơ phần khơng chứa nước, lau khơ nút và đậy lại. Lấy bình ra khỏi nồi điều nhiệt, lau khơ phía ngồi bình rồi đem cân ta được m2 gam. Tiếp theo đổ nước khỏi bình, tráng bình 2 đến 3 lần bằng dung dịch cần đo tỷ trọng rồi cũng rót chất lỏng tới trên vạch, sau đó làm tương tự như khi bình chứa nước cất, cân được khối lượng m3 gam. Tính d2020, tra phụ lục ta biết được nồng độ rượu cần đo [9].
d2020 = 1 2 1 3 m m m m − −
3.5.2.3 Phương pháp định lượng acid
Nguyên tắc: dựa trên phản ứng trung hòa các acid có trong mẫu bằng dung dịch kiềm NaOH 0,1N với chất chỉ thị là phenolphtalein. Từ lượng dịch kiềm tiêu hao, ta tính đượng acid tổng số có trong mẫu [9].
Hàm lượng acid tổng (tính theo g acid trên 1 lít (g/l)) được tính theo cơng thức:
V K
n
Ax =( × ×1000)/ , g/l. Trong đó:
Ax: lượng acid có trong 1 lít sản phẩm, g/l;
n: số ml NaOH 0,1N tiêu hao khi định phân mẫu thực, ml; V: lượng mẫu mang đi phân tích.
K: số g acid tương ứng với 1ml NaOH 0,1N. (Với: Acid citric K=0,0064).
Ngun tắc: Acid L-ascorbic có tính khử mạnh được oxy hóa bằng dung dịch I2
với chỉ thị là dung dịch tinh bột. Điểm kết thúc của phản ứng nhận biết được nhờ chỉ thị dung dịch tinh bột. Đây là phương pháp xác định nhanh và cho kết quả gần đúng.
Tiến hành: Lấy 10ml dịch quả cho vào bình tam giác 250ml, cho 5ml dung
dịch H2SO4 và thêm vài giọt tinh bột, lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng I2 0,01N tới khi bắt đầu xuất hiện màu xanh [9].
Kết quả: Lượng vitamin C được tính theo cơng thức sau:
Hàm lượng vitamin C=
V n×0,88×1000
, mg/l.
Trong đó: n: số ml dung dịch I2 0,01N dùng để chuẩn độ; 0,88: số mg vitamin C tương ứng với 1ml I2 0,01N;
V: số ml dịch quả đã lấy để phân tích.
3.5.2.5 Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm
Đánh giá cảm quan là kỹ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để nhận biết, mơ tả và định lượng các tính chất cảm quan của một sản phẩm như màu sắc, hình thái, mùi, vị và cấu trúc. Ở đây chúng tôi sử dụng phương pháp cho điểm chất lượng tổng hợp của sản phẩm để đánh giá về chất lượng cảm quan của sản phẩm rượu bưởi.
Phương pháp cho điểm :
Phương pháp cho điểm được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của một sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, mùi, vị và trạng thái. Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm. Giá trị điểm tăng theo mức tăng của chất lượng sản phẩm. Do các chỉ tiêu có vai trị đối với chất lượng chung của sản phẩm ở mức khác nhau nên các giá trị cho được đối với mỗi chỉ tiêu được nhân thêm một giá trị tương ứng gọi là hệ số trọng lượng. Các chỉ tiêu có vai trị lớn hơn thì có hệ số trọng lượng cao hơn. Tổng điểm của các chỉ tiêu là điểm chất lượng của sản phẩm. Điểm này quyết định mức chất lượng của sản phẩm được đánh giá [13].
Bảng 3.1: Bảng điểm đánh giá các chỉ tiêu của sản phẩm rượu bưởi (TCVN 3217 – 79)
Tên chỉ tiêu Điểm chưa có
trọng lượng Yêu cầu
Độ trong và màu sắc
5 Trong, không vẩn đục, màu vàng nhạt sáng, màu hoàn tồn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Trong, khơng vẩn đục, màu vàng nhạt.
3 Trong, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm, màu vàng.
2 Hơi đục, màu không đặc trưng cho sản phẩm, màu vàng sậm.
1 Đục nhiều, lắng cặn, màu không đặc trưng cho sản phẩm, màu vàng sậm đen.
0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng, có xuất hiện màu lạ
Mùi
5 Hịa hợp, thơm dịu, hồn toàn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chưa hồn tồn hịa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm nhưng hơi khó nhận thấy.
3 Hơi nồng, ít đặc trưng cho sản phẩm.
2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm.
1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, khơng đặc trưng cho sản phẩm.
0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.
Vị
5 Hịa hợp, m dịu, hậu vị tốt, hồn tồn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chưa hoàn tồn hịa hợp, hậu vị vừa phải, hồn tồn đặc trưng cho sản phẩm bình thường. 3 Chưa hịa hợp, hơi gắt và sốc, hậu vị yếu, ít đặc
trưng cho sản phẩm.
2 Đắng, sốc, thoảng vị lạ, ít đặc trưng cho sản phẩm.
1 Đắng, sốc, không đặc trưng cho sản phẩm. 0 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.
Mẫu phiếu đánh giá cảm quan theo phép thử cho điểm:
PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN
Tên sản phẩm: Rượu bưởi. Ngày .. Tháng .. Năm .. Họ tên người kiểm tra:…………………………………… Chữ ký:…….
Rượu bưởi được đánh giá cảm quan qua 4 chỉ tiêu với các hệ số trọng lượng như sau:
Bảng 3.2: Hệ số trọng lượng của các chỉ tiêu
Chỉ tiêu Hệ số trọng lượng Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1 Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống Saccharomyces cerevisae F28 Quan sát vi thể và đại thể tế bào nấm men:
Các chỉ tiêu Điểm (0-5) Nhận xét Màu Mùi Vị Trạng thái
Để quan sát hình thái tế bào nấm men ta tiến hành nhuộm đơn tế bào nấm men bằng cách làm tiêu bản giọt ép với thuốc nhuộm fushin. Kết quả chúng tôi quan sát được nấm men Saccharomyces cerevisae F28 có cấu tạo đơn bào, hình trứng, kích thước tương đối lớn.
Tiếp theo để khảo sát tính thuần
của giống chúng tôi tiến hành cấy ria, trải đĩa và tiến hành quan sát khuẩn lạc sau khi ủ được 2 ngày ở nhiệt độ 320C. Quan sát khuẩn lạc sau khi ủ chúng tôi nhận thấy giống Saccharomyces cerevisae F28 nhận được từ phịng thí nghiệm trường Đại Học Bách Khoa là giống thuần. Khuẩn lạc có màu trắng, mọc lồi trên mơi trường thạch, đường kính vào khoảng 1,5-2mm.
Chủng Saccharomyces cerevisae F28 được bảo quản để sử dụng trong suốt q trình tiến hành thí nghiệm.
4.2 Kết quả khảo sát nguyên liệu
Hình 4.1 : Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi
(a) Trải đĩa (b) Cấy ria
Hình 4.2: Khuẩn lạc của Saccharomyces cerevisae F28
Bưởi sau khi ép tiến hành khảo sát các chỉ tiêu: pH, đường khử, đường tổng, acid citric, vitamin C. Thí nghiệm được thực hiện tại phịng thí nghiệm hóa sinh, thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần lặp.
Bảng 4.1: Kết quả xác định một số chỉ tiêu của bưởi Năm Roi tại phịng thí nghiệm Chỉ tiêu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình pH 4,05 4,05 4,05 4,05 Aci tổng(g/l) 5,41 5,42 5,41 5,41 Đường tổng (%) 2,56 2,56 2,57 2,56 Đường khử(%) 3,85 3,85 3,85 3,85 Vitamin C 572 563,2 572 572
Kết quả từ bảng 4.1 cho thấy độ acid và độ pH của nguyên liệu tương đối phù hợp với khả năng lên men của nấm men. Hàm lượng đường tổng, đường khử tương đối thấp không thuận lợi cho q trình lên men. Do đó trong q trình lên men cần bổ sung và điều chỉnh hàm lượng đường thích hợp để quá trình lên men đạt hiệu quả.
4.3 Kết quả q trình lên men rượu
4.3.1 Thí nghiệm khảo sát độ pha loãng của dịch bưởi trước khi lên men rượu
Dịch bưởi sau khi ép tiến hành kiểm tra các thông số: 0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, cảm quan. Sau đó tiến hành pha lỗng mẫu và kiểm tra các thông số như trên để từ đó chọn ra độ pha lỗng thích hợp nhằm đạt hiệu quả cao trong các quá trình lên men sau này.
Ở đây chúng tơi tiến hành pha lỗng dịch bưởi ở các độ pha loãng: 1:0; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4 (dịch bưởi : nước). Dịch bưởi sau khi pha lỗng tiến hành kiểm tra các thơng số và thu được kết quả trong bảng sau:
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của độ pha lỗng của dịch bưởi đến q trình lên men rượu
Độ pha loãng (dịch bưởi : nước) 1:0 1:1 1:2 1:3 1:4 Hàm lượng chất khô (0Bx) 12 6 4 3 2 Đường tổng(g/l) 0,213 0,190 0,141 0,132 0,130 pH 4,05 4,1 4,12 4,27 4,3 Acid tổng(g/l) 7,68 3,45 1,85 1,34 1,12