(sau 4 tuần) CT Nồng độ α-NAA (mg/l) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ TB/chồi (rễ) Chiều dài rễ (cm) 1 1/2 MS 100 3,20 10,13 2 MS 80 1,70 6,52 3 1/2 MS + 0,25 100 6,00 2,89 4 MS + 0,25 100 9,36 1,81 5 1/2 MS +0,5 100 8,02 4,00 6 MS + 0,5 100 11,50 1,68 CV% 0,2 0,2 LSD (5%) 0,18 0,14
Biểu đồ 5.2: Ảnh hưởng của α-NAA đến chiều dài TB của rễ
Qua kết quả thu được cho thấy, sau 4 tuần ni cấy thì chỉ có cơng thức 2 (MS) có 80% chồi ra rễ, cịn các công thức khác đều 100% chồi đều ra rễ. Nhưng số rễ TB/chồi và chiều dài rễ lại có sự biến động khác nhau ở các công thức. Ở các cơng thức có bổ sung α-NAA đều cho số rễ TB/chồi lớn hơn hẳn công thức không bổ sung α-NAA và ở các cơng thức có chất nền là MS cho số rễ TB/chồi lớn hơn ở cơng thức có chất nền là ½ MS. Khi tăng nồng độ α-NAA ở các cơng thức thì số rễ TB/chồi có xu hướng tăng và chiều dài rễ có xu hướng giảm. Cụ thể: Ở các cơng thức có bổ sung α-NAA cho số rễ TB/chồi đạt từ 6,00 – 11,5 rễ, trong khi đó ở cơng thức khơng bổ sung α-NAA chỉ đạt 3,20 rễ (1/2 MS) và 1,70 rễ (MS). Chiều dài rễ ở cơng thức ½ MS đạt 10,13 cm; cơng thức MS đạt 6,52 cm; cịn ở các cơng thức có bổ sung α-NAA đạt 2,89 cm (1/2MS+0,25 mg/lα-NAA), 4,00 cm (1/2MS+0,5mg/l α-NAA), 1,81 cm (MS+0,25mg/l α-NAA) và 1,68 cm (MS+0,5mg/l α-NAA).
Trong các cơng thức thí nghiệm với α-NAA thì cơng thức 6:
MS+0,5mg/l α-NAA cho số rễ TB/chồi đạt cao nhất là 11,50 rễ sau 4 tuần nuôi cấy, nhưng chiều dài rễ dật thấp nhất so với các công thức khác (1,68 cm). Khi tiếp
tục tăng nồng độ α-NAA ở các cơng thức thì số rễ TB/chồi tăng nhưng chiều dài rễ lại giảm.
CT2: MS CT1: ½ MS
Hình 5: Ảnh hưởng của α-NAA đến giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Kết luận: α-NAA có ảnh hưởng lớn tới q trình ra rễ của chồi trầu bà in vitro.
Ở thí nghiệm này cơng thức cho số rễ TB/chồi đạt cao nhất là công thức 6: MS+0,5mg/l α-NAA.
4.2.2. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến giai đoạn tạo cây hồn chỉnh
Than hoạt tính được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu tạo rễ cho chồi
in vitro. Đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu và khẳng định điều này. Từ những năm
1963 Jacquesn và Homes đã sử dụng than hoạt tính để kích thích ra rễ khi ni cấy địa lan. Than hoạt tính được chứng minh có tác dụng rút ngắn thời gian ra rễ của cây chuối từ 15 ngày xuống 10 ngày ( Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 1994). Than hoạt tính ở nồng độ 1g/l có tác dụng kích thích sự ra rễ tập trung, cho chất lượng rễ tốt đối với cây dứa (Nguyễn Thị Nhẫn, 1995).
Về cơ chế tác dụng của than hoạt tính thì có nhiều ý kiến khác nhau, có nhiều tác giả cho rằng than hoạt tính có khả năng hấp thụ các chất độc sản sinh trong nuôi cấy mô và hấp phụ bớt lượng Xytokinin dư thừa khơng có lợi cho q rình ra rễ. Nhưng lại có ý kiến cho rằng than hoạt tính đã tạo ra môi trường tối ( sẫm màu) làm thuận lợi cho q trình phân hóa rễ. Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thanh hoạt tính đến giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh trầu bà được tiến
CT6:MS+0,5 mg/lα-NAA CT5: ½ MS+0,5 mg/lα-NAA
hành trên mơi trường MS có bổ sung than hoạt tính với nồng độ khác nhau từ 0,5 – 2,0 mg/l. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 6
Bảng 6: Ảnh hưởng của than hoạt tính tới giai đoạn tạo cây hồn chỉnh
CT Nồng độ THT (mg/l) Tỷ lệ chồi ra rễ Số rễ TB/chồi (rễ) Chiều dài rễ (cm) 1 0 80% 1,70 6,52 2 0,5 100% 8,01 6,64 3 1,0 100% 9,22 6,77 4 1,5 100% 8,33 6,70 5 2,0 100% 7,79 6,62 CV% 0,1 0,4 LSD (5%) 0,11 0,49
Biểu đồ 6.2: Ảnh hưởng của THT đến chiều dài TB của rễ
Hình 6: Ảnh hưởng của than hoạt tính tới giai đoạn tạo cây hồn chỉnh
Qua bảng 6 cho thấy: Ở tất cơng thức MS chỉ có 81% số lượng chồi tạo rễ, các cơng thức cơng lại đều có 100% chồi tạo rễ qua 4 tuần nuôi cấy. Nhưng số rễ và chiều dài rễ có sự biến động khác nhau ở các công thức. Ở tất cả các cơng thức có
CT3: MS+1,0mg/lTHT Đ/C
bổ sung THT đều cho số rễ TB/chồi và chiều dài rễ lớn hơn hẳn công thức không bổ sung THT.
Cụ thể: Các cơng thức có bổ sung THT cho số rễ TB/chồi đạt từ 7,79 - 9,22 rễ và chiều dài rễ 6,62 – 6,77 cm trong khi đó ở cơng thức Đ/C chỉ đạt 1,72 rễ và 6,53 cm.
Trong các cơng thức thí nghiệm với THT thì cơng thức 3: MS+1,0mg/l THT cho số rễ TB/chồi và chiều dài rễ đạt cao nhất (9,22 rễ và chiều dài rễ 6,77 cm sau 4 tuần nuôi cấy). Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ THT thì số rễ TB/chồi và chiều dài rễ có xu hướng giảm. Do đó, nồng độ THT cao sẽ ức chế khả năng tạo thành số lượng rễ/chồi và chiều dài rễ.
Kết luận: Trong thí nghiệm này cơng thức tốt nhất cho sự tạo rễ của chồi là
cơng thức có bổ sung thêm 1,0mg/l THT. Ở nồng độ này số rễ đạt 9,22 rễ/chồi và chiều dài rễ đạt 6,77 cm.
So sánh bảng 5 và bảng 6 cho thấy:
Với cây trầu bà in vitro: Môi trường tối ưu cho sự ra rễ của chồi bất định thì số rễ TB/chồi trên mơi trường có bổ sung α-NAA lớn hơn trên mơi trường có bổ sung THT. Tuy nhiên, chiều dài rễ trên mơi trường có bổ sung THT lớn hơn mơi trường α-NAA. Mơi trường MS có bổ sung α-NAA cho số lượng rễ lớn nhất là 11,5 rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 1,68cm, cịn mơi trường bổ sung thêm THT cho số lượng rễ lớn nhất là 9,22 rễ/chồi, chiều dài rễ 6,77cm.
Như vậy, tùy điều kiện thực tế mà có thể sử dụng một hoặc hai công thức trên để tạo cây trầu bà in vitro hoàn chỉnh.
4.3. Nghiên cứu các loại giá thể ra cây
* Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới tỷ lệ sống và sự sinh trưởng của cây in vitro
Đây là giai đoạn cuối cùng của quy trình nhân giống in vitro, có ý nghĩa quyết định tới hiệu quả của phương pháp nhân giống. Các cây con hồn chỉnh có đầy đủ rễ, thân, lá từ ống nghiệm được đưa ra ngoài vườn ươm. Cây con chuyển từ trạng thái sống dị dưỡng sang trạng thái sống hoàn toàn tự dưỡng và chịu nhiều tác
động của điều kiện tự nhiên như: nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…Thành công của giai đoạn này có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong các kỹ thuật sau in vitro, bởi vì đó là cơ sở để nâng cao kỹ thuật nhân giống này vào sản xuất. Cây con khi đưa ra vườn ươm có tỷ lệ sống càng cao thì hiệu quả của kỹ thuật nhân giống này càng lớn, ý nghĩa thuyết phục và khả năng ứng dụng cao.
Trước khi đưa cây con ra vườn sản xuất, cần tiến hành cho cây qua giai đoạn vườn ươm để cây con thích ứng với điều kiện sống mới. Ở vườn ươm cây con có thể sinh trưởng thuận lợi, đồng đều và hạn chế được một số tác nhân như: bệnh hại, gió, mưa, ánh sáng trực xạ…
Để tìm giá thể thích hợp cho cây trầu bà in vitro sinh trưởng trong giai đoạn
vườn ươm, cây được tiến hành trồng thử nghiệm trên 4 loại giá thể. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 7 (sau 4 tuần theo dõi)
Bảng 7: Ảnh hưởng của giá thể tới tỷ lệ sống và sự sinh trưởng của cây in Vitro Vitro CT Loại giá thể Tỷ lệ cây sống (%) Chiều cao TB (cm/chồi) Số lá TB (lá/cây) Trạng thái cây 1 Xơ dừa + trấu hun 100 9,69 11,29 ++ 2 Cát 100 7,87 7,83 + 3 Cát + trấu hun 100 7,97 8,86 + 4 Đất + Trấu hun 100 9,00 9,83 + CV% 1,0 0,3 LSD (5%) 0,16 0,57
Ghi chú: ++ Lá xanh đậm, phát triển nhanh + Lá nhạt hơn và phát triển chậm hơn
Biểu đồ 7.2: Ảnh hưởng của giá thể tới số lá TB/cây
Mỗi giá thể ra cây nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 cây
Qua bảng 7 cho thấy: ở các loại giá thể khác nhau thì ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh trưởng phát triển của cây in vitro cụ thể ở công thức 1 (giá thể là trấu hun + xơ dừa) cho kết quả tốt nhất ở tất cả các chỉ tiêu.
Tỷ lệ cây sống ở các loại giá thể đều giống nhau (đạt 100%).Các chỉ tiêu sinh trưởng có sự biến đổi ở các loại giá thể khác nhau.
Cụ thể: Trong các thí nghiệm ra cây, cây được trồng ở giá thể xơ dừa + trấu hun (1:1) có chiều cao trung bình và số lá trung bình đạt cao hơn hẳn so với các cây được trồng trên giá thể khác, chiều cao TB/cây đạt 9,69 cm và số lá TB/cây đạt 11,29 lá.
Ở các loại giá thể khác, chiều cao và số lá TB/cây cũng có những sự biến động khác nhau. Cây ra trên giá thể cát (100%) có chiều cao đạt 7,87cm và số lá TB/cây đạt 7,83cm. Còn trên giá thể cát + trấu hun cây có chiều cao đạt 7,97cm và 8,86 lá/cây. Trên giá thể đất + trấu hun cây có chiều cao 9,0 cm và 9,83 lá/cây. Kết quả trên có thể được lý giải, giá thể cát mất nước nhanh, độ ẩm thấp và có khả năng truyền nhiệt cao nên bộ rễ cây kém thích nghi hơn các loại giá thể khác.
Khi các giá thể được trộ với trấu hun sẽ cho khả năng giữ ẩm và độ tơi xốp cao hơn nên cây sẽ dễ dàng thích nghi hơn, đặc biệt là giá thể trấu hun + xơ dừa rất tơi xốp, thuận lợi cho bộ rễ của cây phát triển.
Kết luận: Khi đưa cây in vitro ra ngồi vườn ươm thì cần chú ý đến việc sử dụng giá thể, phải chọn được loại giá thể thích hợp. Theo kết quả nghiên cứu của thí nghiệm này giá thể xơ dừa + trấu hun là giá thể thích hợp nhất cho cây sinh trưởng và phát triển ở giai đoạn vườn ươm.
CT2 CT1
Hình 7: Ảnh hưởng của giá thể tới tỷ lệ sống và sự sinh trưởng của cây in
vitro
PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Trên cơ sở các kết quả thu được ở phần IV, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Mơi trường thích hợp nhất cho nhân nhanh mẫu cấy trầu bà là: MS + 4mg/l BA
Với hệ số nhân chồi là 5,13 lần, chiều cao TB 0,93 cm và số lá/chồi là 3,24 lá.
2. Mơi trường thích hợp nhất cho q tình tạo cây hồn chỉnh là MS + 0,5mg/l α-NAA
Với số rễ TB/chồi đạt 11,5 rễ và chiều dài rễ đạt 1,68 cm.
3. Ở giai đoạn vườn ươm: Giá thể tốt nhất cho cây in vitro ở giai đoạn vườn ươm là xơ dừa + trấu hun (1:1).
Với tỷ lệ sống đạt 100%, chiều cao TB 9,69 cm và số lá TB 11,29 lá.
5.2. Đề nghị
Dựa trên kết quả nghiên cứu đã đạt được chúng tôi xin đề nghị một số vấn đề sau:
1. Tiếp tục nghiên cứu khả năng nhân nhanh mẫu cấy trầu bà trên đơn chất cũng như tổ hợp các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau ( BA và α-NAA, kinetin và α-NAA, IBA, IAA …)
2. Nghiên cứu tạo cây in vitro từ nguồn vật liệu ban dầu là mẫu lá và cuống lá.
3. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của cây trầu bà sau in vitro (chế độ dinh dưỡng, chế độ tưới nước …) để tạo ra cây trầu bà có phẩm chất tốt hơn.
4. Nghiên cứu tỷ lệ sống, khả năng sinh trưởng, phát triển của cây trầu bà in
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Năng Vịnh (2005); Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng. NXB Nông Nghiệp
2. Lê Văn Tri (1998); Chất điều hòa sinh trưởng và năng suất cây
trồng,.NXB Nông Nghiệp 1998.
3. Nguyễn Văn Uyển và cộng sự; Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật. NXB Nơng Nghiệp 1993.
4. Phạm Hồng Hộ; Cây cỏ Việt Nam. NXB Trẻ 1999
II. Tài liệu nước ngoài
5. Chen J, McConnell DB, Norman DJ, Henny RJ (2005); The foliage plant
industry.
6. Janick J(eds) Horticultural Reviews, John Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ, pp 45-110
7. Dan b. Walker và cộng sự (1983); Direct Respiration of Lipids During Heat
Production in the Inflorescence of Philodendron selloum. Science 22 April
1983,Vol. 220 no. 4595 pp. 419-421
8. Gaurab và cộng sự (2004). Luffa sponge – a unique matrix for tissue culture of Philodendron. Curent Science, vol. 86, no. 2, 25 January.
9. Horticulture Program Eisenhower Park East Meadow, N.Y. 11554
10.Jirakiattikul, Y. and Limpradithtanont (2006); P. Shoot multiplication and
rooting of Philodendron xanadu cultured in vitro. Songklanakarin J. Sci.
Technol., 2006, 28(1) : 79-86
11.Koriesh và cộng sự (2000); M Growth and root formation of
Philodendron oxycardium grown in vitro as affected by benzyladenine and indole acetic acid. Egyptian Journal of Horticulture, 2000 Vol. 27 No. 1 pp.
1-6
12.Jámbor-Benczúr, E. ; Márta-Riffer, A (1990). In vitro propagation of
Philodendron tuxtlanum Bunting with benzylaminopurine. Acta
Agronomica Hungarica, 1990 Vol. 39 No. 3-4 pp. 341-348
13.Kumar Dinesh và cộng sự (1998); In-vitro clonal propagation of
Philodendron pertusum. Indian Journal of Horticulture, vol. 55, issue.4,
1998, 0972-8538
14.McColley RH, Miller NH (1965); Philodendron improvement through
15.Meira Ziv and Tamar Ariel (1991); Bud proliferation and plant
regeneration in liquid-cultured philodendron treated with ancymidol and paclobutrazol. Journal of Plant Growth Regulation, vol10, numbers 1-4,
53-57
16.Mosnica Balanco & Roberto Valverdel (2004); Micropropagación de
Philodendron sp. (Poisblemente P. cocorvandense). Agronomía
Costarricense 28(1): 39 -46, 2004
17.Pablo Peña González và cộng sự (2003); Alternativas del establecimiento
in vitro en la micropropagación de la Guana. Biotecnología vegetal Vol. 3,
No. 1: 43-46, 2003
18.Pierick, R.L.M (1987); In vitro culture of higher plant . Martinus Nijhoff publishers 344 P
19.Sreekumar S và cộng sự (2001); Morphogenetic responses of six
Philodendron cultivars in vitro. Indian J Exp Biol, 2001 Dec;39(12):1280-7
III. Tài liệu Internet
20.Botany .com
21.Cross-Culture Training www.Cross-Ways.com
22.http://en.wikipedia.org/wiki/Philodendron
23.http://mrec.ifas.ufl.edu/foliage/folnotes/philo-hl.htm
24.http://edis.ifas.ufl.edu
25.http://www.exoticrainforest.com
PHỤ LỤC
THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG
MURASHIGE AND SKOOG - 1962(MS)
Thành phần dinh dưỡng Lượng pha cho 1 lít Lượng lấy cho 1 lít MS 1. Đa lượng NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 33 (g) 38 (g) 10 (g) 3,4 (g) 50 (ml/l) 2. Vi lượng H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.4H2O KI MoO4Na2.2 H2O CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O 620 (mg) 2230 (mg) 860 (mg) 83 (mg) 25 (mg) 2,5 (mg) 2,5 (mg) 10 (ml/l) 3. Sắt FeSO4.7H2O Na2EDTA 5,56 (g) 7,46 (g) 5 (ml/l) 4. Vitamin Glycine Axit Nicotinic (B5) 400 (mg) 100 (mg) 5 (ml/l)
Pyridoxin (B6) Thiamin HCl (B1) 100 (mg) 20 (mg) 5. CaCl2.2H2O 6,6 (g) 50 (ml/l) 6. Inositol 100 (mg/l)
Tóm tắt quy trình nhân nhanh in vitro cây trầu bà – Philodendron Xanadu
Vật liệu ban đầu
Tái sinh tạo chồi và nhân nhanh
Tạo cây hoàn chỉnh
Trồng ra giá thể
Đỉnh sinh trưởng
Khử trùng
Môi trường MS+4mg/lBA
BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE BA 14/ 8/11 18: 8
------------------------------------------------------------------ :PAGE 1
Nghien cuu anh huong cua BA toi kha nang tao choi
cua mau cay
VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 24.1570 4.83141 ****** 0.000 2