Nguyên liệu Thành phần (%) Protein (%) Lipid (%)
Đậu tương Ấn Độ (44%/3,4%) 1,5 0,66 0,05 Bột cá (60%/ 6,5% ) 60,0 36,0 3, Bột mì (12%/1,7%) 4,0 0,48 0,07 Gluten ngơ (60%/0,5%) 8,5 5,1 0,03 Vitamin hỗn hợp (F1 0,40 0 Hỗn hợp khoáng (F2) 0,25 0 0
Chất chống ơ xy hố 0,01 0 0
Chất chống mốc 0,10 0 0
Decanxi Phosphate (27%) 1,0 0
Bột sắn (2%/1%) 4,2 0,08 0
Dầu gan mực 20,0 0 20,0
Thành phần dinh dưỡng của thức ăn sản xuất (tính theo vật chất khơ) Trung bình ± SD
Độ ẩm (%) 13,3 ± 0,2 Tro (%) 12,7 ± 0,1
Protein (%) 42,3 ± 0,6 Chất xơ (%) 4,7 ± 0,2
Lipid (%) 23,9 ± 0,5
Trong giai đoạn từ 2011-2013, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 đã triển khai đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme để sản xuất thức ăn nuôi cá hồi và cá tầm”.
Thức ăn cho cá hồi có bổ sung enzym với hàm lượng protein/lipid là 42/20 mang lại tỷ lệ sống lớn hơn 92%, tốc độ tăng trưởng 5,9 g/con/ngày và FCR nhỏ hơn 1,4. Đề tài cũng đã phối hợp triển khai sản xuất thức ăn tại Trung tâm Tư vấn thiết kế và chuyển giao công nghệ thủy sản - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1 và nhà máy chế biến thức ăn chăn nuôi Kinh Bắc với tổng sản lượng là 28.157 kg. Thức ăn đảm bảo được yêu cầu về chất lượng dinh dưỡng cũng như cảm quan của viên thức ăn và được thử nghiệm tại các tỉnh Lai Châu, Lào Cai, Sơn La. Mơ hình sản xuất thức ăn cho cá hồi và cá tầm mang lại hiệu quả kinh tế cho đơn vị sản xuất là từ 500-1500VNđ/kg thức ăn. Giá thành thức ăn là 35.000 VNđ/kg thức ăn cá hồi rẻ hơn so với giá của thức ăn nhập ngoại (tại thời điểm nghiên cứu là >40.000VNđ/kg thức ăn) [99].
1.8.4.Nghiên cứu bổ sung canthaxanthin vào thức ăn thủy sản ở Việt Nam
Nghiên cứu của Trình Mai Duy Lưu và cộng sự đã xác định được ba chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp canthaxanthin, tuy nhiên mới dừng ở mức độ phịng thí nghiệm [100].
Ở Việt Nam, có rất ít nghiên cứu về việc bổ sung canthaxanthin vào thức ăn trong nuôi trồng thủy sản. Năm 2011-2013, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 đã tiến hành bổ sung các sắc tố astaxanthin và canthaxanthin đến màu sắc cơ thịt cá hồi vân. Kết quả cho thấy, việc sử dụng các loại thức ăn với tỷ lệ khác nhau về sắc tố astaxanthin và cantaxanthin không cho thấy sự khác biệt nào về khối lượng cá tăng lên và tỷ lệ sống. Thức ăn bổ sung tỷ lệ astaxanthin/cantaxanthin là 40/40 mg cho hiệu quả
CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn
Vi sinh vật
Chủng Paracoccus carotinifaciens VTP20181 được sàng lọc, tuyển chọn bởi Bộ môn Công nghệ Enzyme - Viện Cơng nghiệp Thực phẩm.
Mơi trường thí nghiệm
Mơi trường giữ giống và phân lập: Marine Broth, Marine agar Môi trường cơ bản: Nutrition Broth 01-Merck
2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men
- Canthaxanthin chuẩn: hãng TRC Canada - Ethanol thực phẩm 96% (Việt Nam) - Urê công nghiệp 98% (Việt Nam)
- Glycerol Monostearate: thường được gọi là GMS, là một monoglyceride thường được sử dụng làm chất nhũ hóa trong thực phẩm. Nó có dạng bột mịn, khơng mùi và vị ngọt có tính hút ẩm. Về mặt hóa học, nó là este glycerol của axit stearic.
- Na2SO4 (Việt Nam): Dùng để làm khan nước - Nước cất 2 lần
2.1.3. Nguyên vật liệu nghiên cứu tổng hợp liposome
Dung môi metanol (MeOH), axeton, n-hexan, diclometan, tetrahydrofuran (THF), 2-propanol và axetonitril được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Chất chuẩn canthaxanthin được mua từ TRC Canada; lecithin đậu nành – Australia.
2.2. Thiết bị máy móc
2.2.1. Thiết bị nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn
- Thiết bị lên men BioFlo 510 SIP Bench, Mỹ - Thiết bị ly tâm bán liên tục CEPA Z61, Đức - Thiết bị lên men 3l: Marubishi-Nhật
- Thiết bị lên men 500l: Marubishi-Nhật
- Thiết bị ly tâm lọc: Maximizer 41 Green, WaterSep, Bioseparations, Mỹ - Các thiết bị thơng dụng trong phịng thí nghiệm: tủ cấy, tủ ni, máy lắc, tủ sấy…
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men
- Máy cô quay chân không: Buchi Rotavapor R - 210 - Thiết bị phát siêu âm UP200St - Hielscher – Đức
- Bản sắc ký lớp mỏng silicagel Merck 60 F254 dày 0.2 mm - Bình triển khai bản mỏng
- Tủ sấy, máy sấy - Máy hiện UV-Vis - Tủ hút
- Bơm hút chân không HBS 2RS-0.5 – Việt Nam - Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC
2.2.3. Thiết bị nghiên cứu tổng hợp liposome
- Máy cô quay chân không: Buchi Rotavapor R - 210 - Bơm hút chân không
- Máy đùn mini màng polycác bonate 100nm
- Máy đo kích thước hạt nano SZ-100 (Horiba, Nhật Bản) - Máy phân tích thế zeta (Horiba, Nhật Bản)
- Máy đo màu DSM SalmoFan (Kaiseraugst, Thụy Sĩ)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn2.3.1.1. Phương pháp định lượng sinh khối vi sinh vật 2.3.1.1. Phương pháp định lượng sinh khối vi sinh vật
Hàm lượng sinh khối của vi sinh vật được xác định theo phương pháp của Mira de Orduna [101].
Tiến hành: 10ml môi trường chứa vi sinh vật được ly tâm thu sinh khối tại điều kiện 5000 rpm/min/10 phút. Sinh khối thu được được rửa bằng nước cất với thể tích dịch 10ml/2 lần. Sinh khối sau đó được sấy đến trọng lượng khơng đổi tại 1050C. Trọng lượng sinh khối vi sinh vật (g sinh khối khơ/l) được tính qua sự chênh lệch khối lượng của cốc đựng trước và sau khi sấy.
2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng canthaxanthin
Hàm lượng canthaxanthin tổng số được xác định theo phương pháp của Dan Qiu [102].
250ml chloroform, đưa vào máy ly tâm, thu được dịch trích ly sơ bộ (dung dịch A). Lấy 5ml dung dịch A cô quay chân không ở 550C/150mmHg, thu cặn, hòa tan cặn bằng: 0.5ml ethanol, 0.5ml chloroform và 99ml cyclohexane thu dung dịch phân tích (dung dịch B) (xem hình 2.3.1)
Hình 2.3.1. Quy trình xử lý mẫu xác định hàm lượng canthaxanthin
100 mg mẫu 10ml nước 100ml EtOH 250ml chloroform Ly tâm Đun 600C, trong 5 phút Dung dịch A (5ml)
Cô quay chân không (550C; 150mmHg) 99ml cyclohexane Dịch cơ Dung dịch B (Dung dịch phân tích) Hịa tan 0.5ml etanol 0.5ml chloroform
- Quy trình phân tích canthaxanthin: khởi động thiết bị đo UV, chỉnh bước sóng đến =470nm, sử dụng mẫu blank là cyclohexane. Đo dịch phân tích B tại bước sóng 470nm. Hàm lượng canthaxanthin trong dịch mẫu được xác định theo cơng thức:
= Trong đó:
A: độ hấp phụ của dung dịch mẫu tại bước sóng 470nm 5000: hệ số pha lỗng
A(1%): độ hấp phụ của dung dịch canthaxanthin 1% pha trong cyclohexane xác định bằng thực nghiệm, A= 2100
M: trọng lượng mẫu phân tích
2.3.1.3. Phương pháp xác định sản lượng canthanxanthin
Sản lượng canthaxanthin được xác định theo cơng thức: =
Trong đó:
msk: hàm lượng sinh khối vi sinh vật (g sinh khối khô/l) Cx (g/g): hàm lượng canthaxanthin vi sinh vật
SCX ((g/l): sản lượng canthaxanthin vi sinh vật
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men2.3.2.1. Xác định hàm lượng tổng carotenoid 2.3.2.1. Xác định hàm lượng tổng carotenoid
Để xác định hàm lượng tổng carotenoids, lấy 15 gam mẫu đem chiết với 25ml acetone sau đó tiến hành lọc chân khơng ba lần, quá trình chiết được thực hiện 3 lần đến khi dịch chiết nhạt màu. Dịch chiết này sau đó được chuyển đến bình chiết phân bố dung tích 500 ml có chứa 40 ml ete dầu hỏa. Acetone được loại bỏ bằng cách bổ sung chậm nước tinh khiết để ngăn chặn sự hình thành nhũ tương. Các thành phần carotenoid sẽ chuyển sang pha ete dầu hỏa, pha nước hòa tan acetone được loại bỏ dần. Quá trình lặp được thực hiện lặp lại bốn lần cho tới khi khơng cịn acetone. Pha ete dầu hỏa chứa carotenoid được chuyển sang bình 50 ml có chứa natri sulfat khan để loại bỏ hoàn toàn nước. Dịch ete dầu hỏa chứa carotenoid được so quang ở bước sóng
Trong đó: A: độ hấp thụ
V: tổng thể tích mẫu P: khối lượng mẫu
: β-carotene Extinction Coefficient trong ete dầu hỏa ( : =2592)
2.3.2.2. Xác định hàm lượng canthaxanthin bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Mẫu được chiết tách bằng phương pháp chiết siêu âm (chiết có hỗ trợ của sóng siêu âm) với hệ dung môi là chloroform-methanol (2:1; v/v), hiệu suất chiết đạt khoảng 95%. Cô đặc dịch chiết và tiến hành đông khô mẫu thu được cao chiết tổng. Hàm lượng canthaxanthin trong cao tổng được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Điều kiện chạy máy gồm: pha động là hệ dung mơi axetonitril: methanol (95:5; v/v), Cột phân tích C18 (4.6mm x 250mm, cỡ hạt 5µm), Detector PDA hoặc UV-Vis, bước sóng 475nm. Trong đó thể tích bơm mẫu 20 µl, tốc độ dòng 1ml/phút, nhiệt độ buồng chạy mẫu: 300C.
Từ chất chuẩn canthaxanthin, sử dụng phương pháp HPLC tiến hành xây dựng đồ thị đường chuẩn thể hiện tương quan giữa hàm lượng canthaxanthin và diện tích peak. Dựa vào đồ thị đường chuẩn sẽ xác định được hàm lượng canthaxanthin trong các mẫu thử.
2.3.2.3. Phương pháp sắc kí lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715) và RP-18 F254s (Merck).
Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở 2 bước sóng 254nm và 365nm. Sử dụng là dung dịch H2SO4 5% phun lên bản mỏng và hơ nóng trên bếp điện đến khi hiện màu các hợp chất, một số thuôc thử khác như dung dịch vanilin/ H2SO4 (1%), dung dịch Fe3+/H2SO4 (1%), thymol/ H2SO4 (0,5%).
2.3.2.4. Phương pháp sắc kí cột
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt 0.04 0.063 mm (240 ÷ 430 mesh). Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30 50µm). Selphadex LH-20 (Merck).
2.4. Phương pháp nghiên cứu tạo sản phẩm thức ăn cho cá hồi chứacanthaxanthin canthaxanthin
2.4.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp bổ sung chế phẩm canthaxanthin
Chế phẩm giàu canthaxanthin được tiến hành bổ sung vào thức ăn cho cá hồi bằng các phương pháp sau:
- Phương pháp phối trộn vào nguyên liệu trước khi ép đùn: Cân một lượng chính xác chế phẩm chứa canthaxanthin được làm giàu từ đề tài bổ sung vào hỗn hợp nguyên liệu trong qúa trình phối trộn các nguyên liệu của nhà máy. Hỗn hợp nguyên liệu chứa chế phẩm canthaxanthin này sẽ trải qua các bước sản suất của nhà máy: Trộn, nghiền, cấp hơi nấu chín, ép đùn, sấy khơ và áo dầu. Nhiệt độ trong buồng trộn: 80950C và trong thời gian 3 phút, tiếp sau đó hỗn hợp nguyên liệu sẽ được di chuyển sang vị trí đầu ép viên với nhiệt độ lên tới 120÷1350C, 2040 bar và trong thời gian 30 giây.
- Phương pháp trộn chế phẩm canthaxanthin vào viên thức ăn (phủ ngồi viên thức ăn): Cân một lượng chính xác chế phẩm canthaxanthin được làm giàu, hòa tan trong dầu ở nhiệt độ 65÷700C. Sử dụng hỗn hợp chất lỏng này phun lên thức ăn (áo dầu thức ăn). Thức ăn sau khi được áo dầu sẽ được làm khơ và đóng bao.
- Phương pháp trộn liposome có chứa canthaxanthin vào thức ăn: trộn thức ăn khơng chứa cantaxanthin và liposome có chứa các hàm lượng canthaxanthin khác nhau.
Thức ăn thành phẩm của các phương pháp bổ sung sẽ được thu mẫu và phân tích tại phịng thí nghiệm dinh dưỡng thủy sản thuộc trung tâm Công nghệ Sinh học nhằm xác định hàm lượng canthaxanthin chứa trong thức ăn sau q trình gia cơng.
2.4.2. Phương pháp xác định liều lượng bổ sung canthaxanthin vào thức ăn cá hồi
Tiến hành bổ sung chế phẩm canthaxanthin vào thức ăn cho cá Hồi vân với các liều lượng khác nhau và trộn thức ăn với liposome có chứa canthaxanthin với tỷ lệ khác nhau và tiến hành cho cá ăn với cách bố trí thí nghiệm như sau:
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 công thức
và mỗi công thức được lặp lại 3 lần. 270 con cá hồi có khối lượng trung bình 150g/con được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên vào 9 bể ximăng 4m3 với hệ thống nước chảy tràn liên tục.
hàng ngày vào lúc 6h và 14h. NO2, NH3, H2S và NO2 được test vào lúc 6h hàng ngày. Định kỳ 1 tháng cân mẫu 1 lần để kiểm tra tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống.
Các chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ sống, khối lượng cá tăng lên, tốc độ tăng trưởng
bình quân ngày, hệ số chuyển đổi thức ăn, màu sắc, hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng chất dinh dưỡng trong cơ thịt cá.
Đánh giá hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng trưởng của cá nuôi:
Tỷ lệ tăng trưởng tuyệt đối (SGR) (% khối lượng thân/ngày)=[(ln Wf (g) - ln Wi (g))/thời gian ni (ngày)]×100
(kg)
cá:
Tỷ lệ sống (S) (%)=(Tổng số cá thu/Tổng số cá)×100
Phương pháp đánh giá màu sắc cơ thịt và hàm lượng canthaxanthin trong cơ thịt
- Số lượng mẫu thu: 10 mẫu /1 lơ thí nghiệm. Vị trí lấy mẫu so màu: cơ thịt cá vị trí giữa thân. Thời gian thu mẫu định kỳ: 30 ngày/lần.
- Phương pháp so màu: sử dụng thước đo màu SalmoFan Lineal để cho điểm theo thang điểm từ 20 đến 34 và điểm trung bình của 3 người quan sát khác nhau sẽ là điểm sử dụng để đánh giá [103].
Xác định nồng độ canthaxanthin trong cơ thịt: mẫu cơ thịt cá được thu tại cùng
một vị trí trên cơ lưng, 10 mẫu/lơ thí nghiệm sẽ được tách chiết bằng dung mơi hữu cơ, làm sạch và phân tích bằng máy sắc khí lỏng cao áp HPLC.
2.5. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa q trình cơng nghệ
Sau khi lựa chọn được các yếu tố cơng nghệ chính cần nghiên cứu và khảo sát ảnh hưởng đơn yếu tố của chúng tới quá trình. Tiếp theo sẽ tiến hành thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm theo mơ hình kế hoạch trực giao bậc hai của Box-Willson, kế hoạch chu bản bậc hai Box-Hunter hoặc kế hoạch Box-Behnken [82; 83]. Tùy vào yêu cầu của từng bài toán cụ thể và sự hiểu biết sơ bộ về ảnh hưởng của các biến mà lựa chọn mơ hình khảo sát để nghiên cứu và tối ưu hóa q trình cơng nghệ. Số thí nghiệm của ma trận kế hoạch được tính theo cơng thức sau:
- Đối với mơ hình bậc 2 của Box-Willson:
N = 2k + 2k + n0 với k < 5 và k=5 N = 2k-1 + 2k + n0 với k > 5
(N: số thí nghiệm; k: số yếu tố cơng nghệ; n0: số thí nghiệm tại tâm) Các mức của kế hoạch thực nghiệm sau khi được mã hóa bao gồm (-α; -1; 0; +1; +α). Trong đó α gọi là cánh tay địn và được tính theo cơng thức:
α 4 + 2k α2 – 2k-1(k + 0.5 n0) = 0 với k < 5 α 4 + 2k-1 α2 – 2k-2(k + 0.5 n0) = 0 với k > 5
Sau khi tính tốn được giá trị cánh tay địn α, ta sẽ thiết lập được ma trận kế hoạch thực nghiệm. Dựa vào đây ta có các thí nghiệm để tính tốn giá trị các hàm mục tiêu Y.
- Đối với mơ hình bậc 2 của Box – Hunter
N = 2k + 2k + n0 với k < 5 và k=5 N = 2k-1 + 2k + n0 với k > 5
(N: số thí nghiệm; k: số yếu tố cơng nghệ; n0: số thí nghiệm tại tâm) Các mức của kế hoạch thực nghiệm sau khi được mã hóa bao gồm (-α; -1; 0; +1; +α). Trong đó α gọi là cánh tay địn và được tính theo cơng thức:
α = 2k/4 (khi nhân kế hoạch 2k) α = 2(k-1)/4 (khi nhân kế hoạch 2k-1)
Số điểm ở tâm kế hoạch n0 được tăng lên để ma trận không suy biến, các giá trị α và n0 với số biến k khác nhau được cho ở bảng sau: