CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tối ưu quá trình lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn
4.1.2.2. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin bằng mơ hình RSM-
CCD.
Thí nghiệm tối ưu hóa các yếu tố môi trường lên men sinh tổng hợp canthaxanthin bằng P.carotinifaciens VTP20181 sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt, kế hoạch chu bản bậc hai Box-Hunter. Dựa vào các kết quả đã được khảo sát ở phần trước, chúng tôi lựa chọn các biến công nghệ được nghiên cứu gồm pH, nhiệt độ, tốc độ lắc, tỷ lệ giống và thời gian lên men mức thí nghiệm (-α; -1; 0; +1; + α). Trong đó số thí nghiệm tại tâm n0 = 6 và cánh tay đòn α = 2. Kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 4.1.4. Giá trị biến thực và biến mã hóa trong kế hoạch thực nghiệm Box – Hunter (CCD) Biến thực Biến mã hóa Khoảng biến thiên (Δ) Mức khảo sát -α -1 0 +1 +α Độ pH A 0.75 5.75 6.5 7.25 8 8.75 Nhiệt độ (0C) B 5 15 20 25 30 35
Thời gian (giờ) C 12 36 48 60 72 84
Tỷ lệ giống (%) D 2.5 2.5 5 7.5 10 12.5
Tốc độ lắc (vòng/phút)
E 100 100 200 300 400 500
Với α = 2.0
Hai hàm mục tiêu được nghiên cứu tối ưu bao gồm Y1 (mg/g) là hàm lượng canthaxanthin trong sinh khối và Y2 (mg Cx/l) là hiệu suất tạo canthaxanthin. Kết quả ma trận kế hoạch thực nghiệm xây dựng được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 4.1.5. Ma trận kế hoạch thực nghiệm điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin
Thí nghiệm
Biến mã hóa Y1 (mg/g) Y2 (mg Cx/l)
A B C D E nghiệmThực Tính tốn nghiệmThực Tính tốn
1 -1 -1 -1 -1 +1 2.01 1.97 11.42 9.83 2 +1 -1 -1 -1 -1 1.31 1.37 8.14 8.92 3 -1 +1 -1 -1 -1 4.11 4.13 30.37 29.97 4 +1 +1 -1 -1 +1 2.28 2.39 18.81 19.29 5 -1 -1 +1 -1 -1 2.65 2.61 16.67 16.78 6 +1 -1 +1 -1 +1 1.31 1.35 9.2 10.19 7 -1 +1 +1 -1 +1 4.01 4.02 33.32 33.12 8 +1 +1 +1 -1 -1 3.18 3.29 26.97 29.14 9 -1 -1 -1 +1 -1 3.02 3.01 18.03 19.23 10 +1 -1 -1 +1 +1 1.47 1.54 10.47 12.56 11 -1 +1 -1 +1 +1 3.92 3.96 33.12 34.02 12 +1 +1 -1 +1 -1 3.34 3.48 29.63 32.90 13 -1 -1 +1 +1 +1 2.78 2.75 20.32 21.73 14 +1 -1 +1 +1 -1 2.24 2.31 16.2 19.98 15 -1 +1 +1 +1 -1 5.34 5.38 48.22 50.81 16 +1 +1 +1 +1 +1 3.09 3.22 28.86 32.33 17 - 2 0 0 0 0 1.87 1.97 6.19 6.81 18 + 2 0 0 0 0 0.033 -0.24 0.15 -5.73 19 0 - 2 0 0 0 0.64 0.67 3.45 1.69 20 0 + 2 0 0 0 4.41 3.90 40.79 37.28 21 0 0 - 2 0 0 5.01 4.91 50.2 49.47 22 0 0 + 2 0 0 5.75 5.68 65.84 61.31 23 0 0 0 - 2 0 5.72 5.68 59.49 60.95 24 0 0 0 + 2 0 6.94 6.81 84.25 77.53 25 0 0 0 0 - 2 6.28 6.18 73.73 69.61 26 0 0 0 0 + 2 5.17 5.09 62.09 60.95 27 0 0 0 0 0 8.41 8.63 108.02 114.73 28 0 0 0 0 0 8.53 8.63 115.11 114.73 29 0 0 0 0 0 8.64 8.63 114.06 114.73 30 0 0 0 0 0 8.78 8.63 115.25 114.73 31 0 0 0 0 0 8.55 8.63 115.77 114.73 32 0 0 0 0 0 8.67 8.63 117.05 114.73
Kết quả phân tích phương sai ANOVA được thể hiện ở bảng sau
Bảng 4.1.6. Kết quả phân tích thống kê ANOVA đối với 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2
Nguồn Hàm Y1 (mg/g) Hàm Y2 (mgCx/l)
F-value p-value F-value p-value
Mơ hình 335.60 < 0.0001* 102.49 <0.0001*
B 489.77 < 0.0001* 83.39 < 0.0001* C 27.72 0.0003* 9.23 0.0113* D 59.70 < 0.0001* 18.10 0.0014* E 55.55 < 0.0001* 4.94 0.0481* AB 3.60 0.0842NS 0.92 0.3576 AC 0.18 0.6835 NS 0.36 0.5622 NS AD 0.094 0.7645 NS 0.095 0.7642 NS AE 0.45 0.5167 NS 0.0062 0.9384 NS BC 1.25 0.2880 NS 0.34 0.5723 NS BD 0.028 0.87 NS 0.32 0.5840 NS BE 2.03 0.1823 NS 0.50 0.4958 NS CD 0.13 0.7236 NS 0.067 0.8010 NS CE 0.028 0.87 NS 0.044 0.8375 NS DE 2.11 0.1745 NS 0.27 0.6140 NS A² 3443.86 < 0.0001* 1049.44 < 0.0001 B² 2296.70 < 0.0001* 730.04 < 0.0001 C² 635.47 < 0.0001* 283.42 < 0.0001 D² 324.98 < 0.0001* 165.56 < 0.0001 E² 510.79 < 0.0001* 196.82 < 0.0001 Lack of fit 2.74 0.1443 NS 3.58 0.0915 NS R2 0.9984 0.9947 Adj- R2 0.9954 0.9850 Adeq Precision 61.136 31.156
*p < 0.05: Các giá trị có ý nghĩa; NSp > 0.05: các giá trị khơng có ý nghĩa
Kết quả phân tích của mơ hình ở bảng 4.1.4 cho thấy mơ hình này là hồn tồn tương hợp với thực nghiệm, điều này được chứng minh với các chuẩn F (Fisher) của mơ hình có giá trị với hàm Y1 (335.6) và Y2 (102.49). Các mơ này có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy cao với các giá trị p-value đều nhỏ hơn 0.0001.
Sự phù hợp của mơ hình thực nghiệm cũng được kiểm chứng bằng hệ số xác định R2. Giá trị R2 càng gần 1 thì giá trị thực nghiệm càng gần với giá trị dự đoán của mơ hình. Theo số liệu phân tích ở bảng 4.1.4, hệ số xác định R2 của 2 mơ hình Y1 và
Y2 lần lượt có giá trị là 0.9984 (99.84%); và 0.9947 (99.47%), Bên cạnh đó giá trị Adj- R2 của mơ hình Y1 và Y2 lần lượt có giá trị là 0.9954 (99.54%) và 0.9850 (98.50%). Theo Guan and Yao (2008) và Zabeti et al. (2009) thì mơ hình có tính tương hợp cao với thực nghiệm khi giá trị R2 và Adj-R2 lớn hơn 0,8 cùng với đó chỉ số Adeq Precision lớn hơn 4 là cần thiết. Từ các kết quả thu được ta có thể khẳng định mơ hình đã xây dựng là có tính tương hợp cao với thực nghiệm.
Một cách khác, chúng tơi có thể đánh giá sự tương hợp của mơ hình thơng qua các biểu đồ thực nghiệm và dự đốn (predicted and actual value plots) và các biểu đồ phân bố ngẫu nhiên của các lần thí nghiệm (residuals versus runs models) thể hiện ở hình 4.7.1. Mơ hình có sự tương hợp cao giữa thực nghiệm và lý thuyết khi các điểm thí nghiệm tập trung theo dạng đường chéo thẳng ở đồ thị thứ nhất và phân bố của các điểm thí nghiệm là ngẫu nhiên trong phạm vi (-3, 3) ở đồ thị thứ 2.
Hình 4.1.7. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2
Sau khi loại bỏ các biến khơng có ý nghĩa (p> 0.05). Hàm mục tiêu Y1 và Y2 của mơ hình cũng được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:
Y2 = 114.73 - 3.14A + 8.90B + 2.96C + 4.14D - 2.17E - 28.55A² - 23.81B² - 14.84C² - 11.37D² - 12.36E² (2)
Sự ảnh hưởng của các yếu tố tuyến tính (A, B, C, D, E) đến giá trị hàm mục tiêu là lớn nhất, sau đó là ảnh hưởng của các hiệu ứng tương tác chập đôi (AB, AC, AD, BC, BD, CD) và ảnh hưởng ít nhất đến giá trị hàm mục tiêu là các yếu tố bình phương (A2, B2, C2, D2 và E2). Trong 2 phương trình hồi quy (1) và (2) đều khơng thể hiện sự ảnh hưởng của các hiệu ứng tương tác chập đơi.
+ Từ phương trình hồi quy (1) ta có thể thấy ngay ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng canthaxanthin). Ta thấy cả 4 yếu tố A, B, C và D đều ảnh hưởng tương tác dương (ảnh hưởng đồng biến) với hàm Y1. Trong đó mức độ ảnh hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần B > D > C tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình hồi quy (1). Ngược lại thì 2 yếu tố cơng nghệ A và E lại ảnh hưởng tương tác âm (ảnh hưởng nghịch biến) với hàm Y1. Mức độ ảnh hưởng của yếu tố công nghệ A lớn hơn yêu tố công nghệ E tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình hồi quy (1).
+ Tương tự như vậy, phương trình hồi quy (2) cho thấy ngay ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm mục tiêu Y2 (hiệu suất tạo canthaxanthin). Ta thấy 3 yếu tố B, C và D ảnh hưởng tương tác dương (ảnh hưởng đồng biến) với hàm Y2. Trong đó mức độ ảnh hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần B > D > C tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình hồi quy (2); Trong khi đó 2 yếu tố cơng nghệ A và E lại ảnh hưởng tương tác âm (ảnh hưởng nghịch biến) với hàm Y2. Mức độ ảnh hưởng của yếu tố công nghệ A lớn hơn yêu tố công nghệ E tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình hồi quy (2).
Khi quy đổi sang biến thực, chúng tơi có một số nhận xét như sau:
+ Đánh giá hàm đáp ứng Y1, nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ giống có ảnh hưởng tích cực đến hàm lượng canthaxanthin sinh tổng hợp khi tăng tuyến tính cịn độ pH và tốc độ lắc có ảnh hưởng tiêu cực đến hàm đáp ứng Y1 với mức ảnh hưởng bậc 2. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đó về q trình sinh tổng hợp canthaxanthin bởi vi khuẩn P.carotinifaciens [111].
+ Đối với hàm đáp ứng Y2 cũng tương tự, nhiệt độ, tỷ lệ giống và thời gian có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tạo sinh khối của P.carotinifaciens VTP20181 khi tăng tuyến tính nồng độ trong mơi trường, gián tiếp tăng hiệu suất sinh tổng hợp hoạt chất. Độ pH và tốc độ lắc có ảnh hưởng tiêu cực đối với hàm đáp ứng này chứng tỏ các mức thí nghiệm có giá trị pH cao gây ức chế khả năng tạo hoạt chất chức năng của vi khuẩn.
Ảnh hưởng của các cặp yếu tố công nghệ thể hiện ở hiệu ứng tương tác đôi đến các hàm mục tiêu được biểu thị thông qua các bề mặt đáp ứng của hàm lượng Y1 và Y2 thể hiện ở hình 4.1.8
(b)
Hình 4.1.8. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin (a) và hiệu suất tạo canthaxanthin (b)
Trên các bề mặt đáp ứng, vùng màu đỏ sẫm là vùng tối ưu. Tại đó, các giá trị hàm mục tiêu Y1 và Y2 nằm trong vùng giá trị lớn nhất. Điểm tối ưu (giá trị lớn nhất của 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2) sẽ được xác định dựa trên các vùng tối ưu, từ đó xác định được điều kiện tối ưu của 5 yếu tối công nghệ ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh khối.
Điều kiện tối ưu sinh tổng hợp canthaxanthin bởi P.carotinifaciens VTP20181 theo mơ hình dự đốn được tính tốn dựa trên phần mềm Design Expert 7.0.0 được thể hiện ở bảng 4.1.7
Bảng 4.1.7. Điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin
TT
Biến mã hóa Giá trị biến mã
hóa Biến thực Giá trị Biến thực 1 A -0.06 pH 7.2 2 B 0.2 Nhiệt độ 26 3 C 0.11 Thời gian 61.32 4 D 0.19 Tỷ lệ giống 7.97
6 Hàm lượng Canthaxanthin
mg/g
8.81
7 Hiệu suất tạo
canthaxanthin
mgCx/l
116.36
Hình 4.1.9. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của hàm mục tiêu Y1 và Y2
Hình 4.1.10. Điều kiện tối ưu quá trình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin theo mơ hình xây dựng được
Tiến hành nghiên cứu thử nghiệm lại quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin ở quy mơ 3 lít với các điều kiện tối ưu được dự đốn theo mơ hình ở trên. Kết quả thực nghiệm thu được hàm lượng canthanxanthin: 8.76 ± 0.17 (mg/g) và hiệu suất tạo
canthaxanthin đạt 115.88 ± 1.12 (mgCx/l). Sự khác biệt giữa kết quả thực nghiệm và kết quả mơ hình dự đốn là khơng đáng kể. Do đó, có thể khẳng định mơ hình tính tốn tối ưu là tương hợp với thực nghiệm và có độ chính xác cao.
4.1.3. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men
- Mục đích: lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối vi sinh vật sau lên men. - Qua quá trình khảo sát các phương pháp thu nhận sinh khối sau sinh tổng hợp bằng các thiết bị sẵn có, chúng tơi đưa ra các thông số thu hồi sinh khối được thể hiện ở bảng 4.1.8.
Bảng 4.1.8. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men
Thí nghiệm Điều kiện thí nghiệm Thơng số đánh giá
Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối
- Lắng, ly tâm: lắng sinh khối ở 40C/24h, ly tâm 10000 rpm, thiết bị ly tâm CEPA, Đức. - Lọc màng: khe lọc 0,6nm, tốc độ dịch: 180200l/h - Ly tâm bán liên tục, tốc độ ly tâm: 15000 rpm, tốc độ dịch: 600l/h
Hiệu suất thu nhận sinh khối
Lựa chọn tốc độ ly tâm
400; 500; 600; 700 vòng/phút Hiệu suất thu nhận sinh
khối Tỷ lệ sinh khối/nước
rửa sinh khối (m/V)
1 /2; 1 /3; 1 /4; 1 /5; 1 /6 Hiệu suất thu nhận sinh
khối, Bx dịch rửa
Số lần rửa 1 lần, 2 lần, 3 lần Hiệu suất thu nhận sinh
khối, Bx dịch rửa Tỷ lệ nước bổ sung
vào sinh khối trước sấy phun
1/1; 1/2; 1/3 Hiệu suất thu hồi chế
phẩm, hàm lượng Cx, cảm quan chế phẩm
Chế độ sấy 1550C/800C /2l/h/20000rpm;
1650C/850C /2.5l/h/20000rpm; 1750C/900C /2.5l/h/20000rpm;
Hiệu suất thu hồi chế phẩm, hàm lượng Cx, cảm quan chế phẩm
- Ly tâm bán liên tục:
Tốc độ: 700 vòng/phút
Số lần ly tâm: 02 lần
Tỷ lệ sinh khối/dịch rửa: 1/5 - Chế độ sấy phun:
Tỷ lệ sinh khối/nước: 1/2 (w/v)
Nhiệt độ đầu vào/ra: 1650/850C
Tốc độ đĩa quay: 20.000 vòng/phút
Tốc độ tiếp liệu: 2.5 lít/h
4.1.4. Quy trình cơng nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn quy mơ 80-100 lít/mẻ
Dựa trên các kết quả nghiên cứu đã có chúng tơi xây dựng hồn thiện quy trình cơng nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ chủng Paracoccus
Nhân giống cấp I
(pH=7.280C, lắc 200v/ph, 48 giờ)
Làm sạch sinh khối
(Khuấy 200 v/ph, 10 phút, li tâm 700 v/ph, rửa 2 lần)
Hình 4.1.11. Quy trình cơng nghệ sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ
Chủng giống
Paracoccus carotinifaciens VTP 20181
Bổ sung nước: sinh khối: H2O=1:5 (w/v)
Dịch thải
Sấy phun
(Nhiệt độ đầu vào/ra: 1650C/850C; tốc độ tiếp liệu 2.5 lít/giờ, tốc độ đầu đầu quay 20000 v/ph)
Nhân giống cấp II
(pH=7.280C, lắc 200v/ph, 35÷38 giờ)
Tiếp thêm bột NM 6g/l tại 36h;
Tiếp thêm sucrose 5g/l tại 24h; 36h;
48h
Dịch thải
Thu hồi sinh khối
(Li tâm 700 v/ph, cơng suất 600 lít/h) Lên men trên thiết bị 500 lít
(pH=7.280C, khuấy 150v/ph, cấp khí 1 l/ ph, 64 giờ)
Nhân giống cấp III
(TB 50 lít, pH=7.280C, sục khí 1l/ph, khuấy150 v/ph, 28÷30 h)
Bổ sung nước: sinh khối: H2O=1:2 (w/v)
Sinh khối khơ giàu canthaxanthin
Thuyết minh quy trình cơng nghệ
1. Chủng giống: Paracoccus carotinifaciens VTP 20181
- Chủng vi khuẩn Paracoccus carotinifaciens VTP 20181 được phân lập từ đất cánh đồng muối khu vực Diêm Điền, Thái Bình. Chủng được nuôi trên môi trường Marine Agar 2216.
- Điều kiện bảo quản: Bảo quản trong ống thạch nghiêng dưới lớp parafin vô trùng, bảo quản ở 40C. Định kỳ 6 tháng kiểm tra, hoạt hóa và bảo quản lại một lần. Bảo quản trong dung dịch glycerol 10% ở -800C. Định kỳ 12 tháng kiểm tra, hoạt hóa và bảo quản lại một lần.
2. Nhân giống các cấp
- Điều kiện nhân tăng sinh: lấy 1 vịng que cấy giống từ ống thạch nghiêng cấy
vào mơi trường tăng sinh Marine broth 2216.5ml môi trường/ống nghiệm, nhiệt độ nuôi cấy ở 280C lắc 200 v/ph, 48 giờ. Sau khi tăng sinh, xác định mật độ giống bằng phương pháp đo quang, giá trị OD(600nm) = 2.53 (tương đương mật độ giống đạt khoảng (2.53)x108 CFU/ml).
- Nhân giống cấp I: Mơi trường nhân giống YTN, nhân giống trên bình tam giác
100 ml, thể tích dịch nhân giống 25 ml, tỷ lệ tiếp giống hoạt hóa 10%, ni ở 280C, lắc 200 vòng/phút, thời gian nhân giống 48 giờ. Kết thúc nhân giống cấp I, xác định mật độ giống bằng phương pháp đo quang, giá trị OD(600nm) = 2.53 (tương đương mật độ giống đạt khoảng (2.53)x108 CFU/ml)
- Nhân giống cấp II: Mơi trường nhân giống YTN, nhân giống trên bình tam
giác 1000 ml, thể tích dịch nhân giống 250 ml, tỷ lệ tiếp giống cấp I 10%, nuôi ở 280C, lắc 200 vịng/phút, thời gian nhân giống 38÷40 giờ. Kết thúc nhân giống cấp II, xác định mật độ giống bằng phương pháp đo quang, giá trị OD(600nm)= 2.53 (tương đương mật độ giống đạt khoảng (2.53) x 108 CFU/ml).
- Nhân giống cấp III: Môi trường nhân giống YTN, nhân giống trên thiết bị lên
men FM-50 Fermentation tank B.E.Marubishi, thể tích dịch nhân giống 10 lít. Dịch nhân giống được điều chỉnh pH trước khi bổ sung muối, dầu phá bọt (được hấp riêng)