Khẩu phần dinh dưỡng
Khối lượng (mg)
Lecithin tocopherolα- Canthaxanthin
Chế độ I Khẩu phần thức ăn thương mại - - -
Chế độ II Khẩu phần thức ăn thương mại
bổ sung 1g/kg lecithin 1000 - -
Chế độ III Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α-tocopherol
- 100 -
Chế độ IV Khẩu phần thức ăn thương mại
bổ sung 20mg/kg canthaxanthin - - 20
Chế độ V Khẩu phần thức ăn thương mại
bổ sung 100mg/kg α-tocopherol và 20mg/kg canthaxanthin
- 100 20
Chế độ VI Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1 g/kg α-tocopherol loaded liposomes
990 10 -
Chế độ VII
Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin trên liposomes (IC=1%)
990 - 10
Chế độ
VIII Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes (IC=0.1%)
990 9 1
Chế độ IX Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes (IC=0.5%)
950 45 5
Chế độ X Khẩu phần thức ăn thương mại
bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes
3.3.5.2. Tiến hành đo khối lượng
Trong quá trình thử nghiệm, cá được cân định kỳ hàng tháng bằng cách lấy trọng lượng trung bình của ba con cá được bắt ngẫu nhiên từ mỗi nhóm. Các chỉ số sinh trưởng của cá được xác định như sau:
Trọng lượng tăng (WG, %) = (Wf - Wi)/Wi) × 100
Tốc độ tăng trưởng cụ thể (SGR) g/ngày = 100 (ln Wf - ln Wi)/t Trong đó:
Wf là trọng lượng cơ thể cuối cùng (g), Wi là trọng lượng cơ thể ban đầu (g) và t là thời gian thí nghiệm (ngày).
3.3.5.3. Xác định thành phần canthaxanthin trong cơ của cá hồi
Sau ba tháng với chế độ ăn thử nghiệm, phi lê cá được thu thập và đo màu bằng máy so màu Salmofan Lineal (DSM Nutritional Products, Kaiseraugst, Thụy Sĩ) trên thang điểm từ 20 đến 34, đây là tiêu chuẩn quốc tế được chấp nhận cho màu cá hồi (Hình 3.3.2). Điểm số được ghi lại cho mỗi mẫu được ba nhà nghiên cứu thống nhất.
Hình 3.3.2. Máy đo màu DSM SalmoFan
Sự phân bố canthaxanthin trong mô cơ của cá được xác định như sau. Đầu tiên, các mẫu cơ được thu thập trên lưng cá và bảo quản ở -200C. Sau đó, canthaxanthin được chiết xuất theo quy trình được mơ tả trước đó. Tóm lại, sau khi được nghiền bằng thiết bị đồng nhất ULTRA-TURRAX® của IKA, các mẫu được chiết xuất bằng dung mơi hữu cơ, sau đó làm sạch và phân tích bằng máy sắc ký HPLC với chất chuẩn canthaxanthin của Sigma Aldrich. Hệ thống sắc ký khí lỏng sử dụng cột phân tích C- 18 Hypersil Gold (5 µm, 150mm x 4.6 mm), tốc độ dòng được cài đặt 1ml/phút. Thời gian lưu là 6 phút. Quy trình được thực hiện tại phịng phân tích của Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1. Tối ưu quá trình lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn 4.1. Tối ưu quá trình lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn 4.1.1. Khảo sát thành phần môi trường sinh tổng hợp canthaxanthin
Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin bởi vi khuẩn P.carotinifaciens. Các thành phần môi trường và nồng độ mỗi thành phần được khảo sát, đánh giá gồm, cơ chất carbon, cơ chất nitơ, hợp chất trung gian thuộc chu trình Kreb chuyển hóa beta carotene thành canthaxanthin; vitamin, acid amin và muối khoáng được lựa chọn dựa trên các kết quả nghiên cứu của Cyplik; Bhosale; Nasri và Tanaka [104]; [33]. Kết quả khảo sát, chọn miền khảo sát sử dụng trong tối ưu hóa thành phần mơi trường lên men sinh tổng hợp canthaxanthin được trình bày sau.
Hình 4.1.1. Ảnh hưởng của cơ chất carbon và nitơ đến sự sinh tổng hợp canthanaxanthin của vi khuẩn P.carotinifaciens VTP 20181
- Đối với cơ chất carbon cho thấy mẫu thí nghiệm sử dụng sucrose có sản lượng canthaxanthin cao nhất so với mẫu đối chứng.
- Đối với nguồn nitơ hữu cơ và vơ cơ, mẫu thí nghiệm sử dụng NH4SO4 có sản lượng canthaxanthin cao nhất so với mẫu đối chứng.
Kết quả này phù hợp với công bố của Cyplik và Tsuboka [104] về khả năng đồng hóa các cơ chất carbon, nitơ của chủng P.carotinifaciens VTP 20181. Chế phẩm từ nấm men chứng tỏ là nguồn cơ chất thích hợp cung cấp chất dinh dưỡng, vitamin, acid amin, các thành phần vi lượng cho q trình sinh trưởng của vi khuẩn thích hợp hơn các nguồn cơ chất nitơ khác. Đánh giá về tính kinh tế và khả năng ứng dụng sản xuất canthaxanthin quy mơ cơng nghiệp, nhóm nghiên cứu lựa chọn sucrose là cơ chất carbon và cơ chất nitơ là NH4SO4 và bột nấm men trong các thí nghiệm tối ưu hóa tiếp
Hình 4.1.2. Ảnh hưởng của hợp chất trung gian, vitamin và acid amin đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181
Các nghiên cứu của Misawa [109] cho thấy canthaxanthin được sinh tổng hợp bởi chủng Paracoccus theo chu trình Krebs. Kết quả nghiên cứu của Misawa và Chougle chứng tỏ các hợp chất trung gian như malate, citrate, acetate, succinate, fumarate…thúc đẩy sinh tổng hợp beta carotene, gián tiếp thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các hợp chất xanthophyll carotene như astaxanthin, canthaxanthin, zeaxanthin… [104; 110].
- Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của các hợp chất trung gian đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181, mẫu thí nghiệm bổ sung malate có hàm lượng canthaxanthin và sinh khối cao nhất so với mẫu đối chứng.
- Các kết quả đánh giá ảnh hưởng của vitamin và acid amin đối với sự sinh tổng hợp canthaxanthin bằng P.carotinifaciens VTP20181 cho thấy Biotin và glutamate là hai tác nhân có ảnh hưởng lớn nhất đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất của
P.carotinifaciens VTP 20181 lần lượt đối với nhóm vitamin và acid amin.
Kết quả này phù hợp với công bố của Cyplik và cộng sự [104] nghiên cứu về ảnh hưởng của Biotin đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất của P.carotinifaciens và nghiên cứu của Misawa và cộng sự [109], đánh giá ảnh hưởng của glutamate trên P.
carotinifaciens đột biến sinh tổng hợp canthaxanthin.
Hình 4.1.3. Ảnh hưởng của hợp chất vô cơ đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181
Các ion kim loại là tác nhân quan trọng đối với sự phát triển và sinh tổng hợp hoạt chất sinh học của vi khuẩn ưa muối, sử dụng nitrate, nitrite cho quá trình hơ hấp [110]. Kết quả khảo sát cho thấy K, Fe, Co và Mg có hàm lượng canthaxanthin và hiệu suất sinh tổng hợp canthaxanthin cao nhất so với mẫu đối chứng, được lựa chọn sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 4.1.1. Đánh giá nồng độ NaCl đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của chủng vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181
Nồng độ NaCl Đơn vị P.carotinifaciens VTP 20181
17.5 g/l + 50 g/l ± 100 g/l - 150 g/l - 200 g/l - 250 g/l - 300 g/l - 350 g/l -
(Ghi chú: - không phát triển, ± phát triển yếu, + phát triển. Tế bào chết được xác định bằng nhuộm xanh methylen, đếm tế bào chết bằng buồng đếm hồng cầu)
Từ bảng 4.1.1 cho thấy để chủng vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181 phát triển tốt cần mơi trường có hàm lượng muối NaCl 17.5g/l.
Từ các kết quả khảo sát trên, tiến hành các thí nghiệm tìm hàm lượng tối ưu của thành phần mơi trường: NH4SO4, KH2PO4, MgSO4, Biotin, monosodium glutamate, CoCl2, FeSO4, bột nấm men, Sucrose, Sodium malate, và NaCl đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin:
Hình 4.1.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181
Từ kết quả khảo sát các thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp canthaxanthin chúng tôi lựa chọn thành phần môi trường như bảng 4.1.2: