Dựa vào kết quả ở hình 4.2.1 ta thấy nhiệt độ ảnh hưởng khá nhiều tới khả năng chiết xuất canthaxanthin cũng như hàm lượng carotenoid tổng. Ở nhiệt độ chiết xuất là 300C, hàm lượng carotenoid tổng thu được là 17.6(mg/g) và hàm lượng canthaxanthin thu được là 14.2(mg/g). Khi nhiệt độ chiết xuất tăng từ 30÷350C thì hiệu suất tăng nhanh và đạt cực đại ở 350C với hàm lượng carotenoid tổng thu được là 18.1(mg/g) và
hàm lượng canthaxanthin thu được là 14.9 (mg/g). Khi ta tiếp tục tăng nhiệt độ lên 400C và 500C thì hàm lượng carotenoid tổng và hàm lượng canthaxanthin đều có xu hướng giảm dần đạt giá trị thấp nhất lần lượt là 15.7 (mg/g) và 12.5 (mg/g) tại nhiệt độ chiết 500C. Có thể thấy rằng nhiệt độ chiết từ 400C trở lên có thể làm phân hủy hoặc oxy hóa các hợp chất carotenoid nên làm giảm hàm lượng của carotenoid trong q trình chiết. Do đó, để đảm bảo cho q trình chiết xuất canthaxanthin và carotenoid tổng đạt hiệu quả cao nhất chúng tôi lựa chọn nhiệt độ chiết xuất ở mức cơ bản là là 350C để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Mức thấp (-1) và mức cao (+1) lần lượt là 300C và 400C.
4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi/ngun liệu tới q trình chiết
Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới hai hàm mục tiêu là hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng được thể hiện ở hình 4.2.2.
Hình 4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi/ngun liệu tới q trình chiết
Từ kết quả chỉ ra ở hình 4.2.2 ta thấy rằng tỷ lệ dung mơi/ngun liệu cũng ảnh hưởng nhiều tới khả năng chiết xuất canthaxanthin và carotenoid tổng. Trong quá trình thí nghiệm ta thấy ở tỷ lệ dung mơi/ngun liệu là thấp (5/1; v/w) thì hiệu quả q trình chiết xuất cịn thấp, hàm lượng canthaxanthin đạt 10.2 (mg/g) và hàm lượng carotenoid tổng đạt 14.7 (mg/g). Khi tăng tỷ lệ chiết lên (7/1; v/w) và (9/1, v/w) thì hiệu suất thu hồi canthaxanthin và carotenoid tổng cũng tăng lên và đạt lớn nhất tại tỷ lệ (9/1; v/w). Tại tỷ lệ (9/1; v/w), hàm lượng camthaxanthin đạt 15.1 (mg/g) và hàm
thay đổi. Điều này có thể giải thích là ở tỷ lệ dung mơi thấp, nồng độ cao chiết trong dung mơi nhanh đạt đến trạng thái bão hịa hơn vì vậy cản trở q trình trích ly các hợp chất trong ngun liệu, do đó hiệu suất chiết sẽ thấp hơn ở các tỷ lệ cao hơn. Do đó, chúng tơi chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 9/1 làm mức cơ bản để tiến hành các thí nghiệm tổng hợp tiếp theo. Mức thấp (-1) và mức cao (+1) lần lượt là 7/1 và 11/1 (v/w).
4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết
Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ thời gian chiết tới hai hàm mục tiêu là hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng được thể hiện ở hình 4.2.3.
Hình 4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết
Dựa vào kết quả ở hình 4.2.3 ta thấy thời gian chiết xuất cũng ảnh hưởng nhiều tới khả năng chiết xuất canthaxanthin và carotenoid tổng. Khi tăng dần thời gian chiết từ 30 phút đến 90 phút thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng tăng tuyến tính lần lượt từ 6.415.0 (mg/g) và 9.318.2 (mg/g). Khi tăng tiếp thời gian chiết xuất lên 120 phút và tiếp đến là 150 phút thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng thay đổi khơng đáng kể. Điều này có thể giải thích là khi thời gian chiết cịn thấp, thời gian thẩm thấu và khuếch tán vật chất là ngắn nên chưa thể vận chuyển hết vật chất từ nguyên liệu ra mơi trường. Khi tăng thời gian đủ dài thì lượng vật chất sẽ được vận chuyển tối đa ra môi trường. Thời gian chiết quá dài cùng không làm tăng thêm hàm lượng vật chất được chiết ra. Do đó, để đảm bảo về hiệu quả chiết xuất cũng như tối ưu về mặt năng lượng và thời gian của q trình, chúng tơi lựa chọn thời gian chiết
xuất là 90 phút làm mức cơ bản cho thí nghiệm tiếp theo. Mức thấp (-1) và mức cao (+1) lần lượt là 60 phút và 120 phút.
4.2.4. Ảnh hưởng của công suất siêu âm tới q trình chiết
Kết quả ảnh hưởng của cơng suất siêu âm tới hai hàm mục tiêu là hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng được thể hiện ở hình 4.2.4.
Hình 4.2.4. Ảnh hưởng của cơng suất siêu âm tới q trình chiết
Dựa vào kết quả ở hình 4.2.4 có thể thấy công suất siêu âm là một trong 4 yếu tố cơng nghệ ảnh hưởng chính tới q trình chiết xuất. Khi cơng suất siêu âm tăng từ 100÷140 (W) thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng tăng mạnh tương ứng lần lượt từ 12.3÷15.2 (mg /g) và 14.5÷18.3 (mg/g). Tiếp tục tăng cơng suất siêu âm lên 160 (W) thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng bắt đầu có xu hướng giảm nhẹ tương ứng còn 15.1 (mg/g) và 18.1 (mg/g). Cơng suất tăng lên 180 (W) thì cả hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng giảm nhanh hơn xuống còn 14.8 (mg/g) và 17.7 (mg/g). Điều này chứng tỏ cơng suất vi sóng ảnh hưởng cả tích cực lẫn tiêu cực đến q trình chiết xuất. Cơ chế này được giải thích là sóng siêu âm đóng vai trị như tác nhân phá bỏ các lớp màng tế bào của vật liệu chiết thông qua việc tạo thành các bong bóng khí nhỏ và liên lục bị vỡ tạo ra lực cắt cực lớn, điều này giúp quá trình khuếch tán vật chất từ vật liệu ra dung môi dễ dàng hơn. Tuy nhiên khi công suất siêu âm vượt ngưỡng lên mức q cao thì q trình trích ly lại bị cản trở do số bong bóng khí hình thành q nhiều, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi bị giảm đi làm
này. Từ kết quả khảo sát, công suất siêu âm ở các mức cơ bản là 140 (W), mức thấp (- 1) và mức cao (+1) được chọn lần lượt là 120 (W) và 160 (W).
4.2.5. Kết quả quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa các thơng số cơng nghệq trình chiết xuất q trình chiết xuất
Dựa vào các kết quả khảo sát đơn biến các thơng số cơng nghệ của q trình chiết xuất sinh khối thu canthaxanthin và carotenoid tổng, chúng tôi lựa chọn mức thí nghiệm cơ bản (mức 0), mức cao (+1) và mức thấp (-1) của các biến công nghệ và xây dựng bảng mã hóa các yếu tố cơng nghệ như sau:
Bảng 4.2.1. Biến mã hóa và các mức thí nghiệm
Biến thực Biến mã Khoảng biến thiên (Δ) Mức nghiên cứu -1 0 1 Z1: Nhiệt độ chiết (0C) A 5 30 35 40
Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)
B 2 7 9 11
Z3: Thời gian chiết (phút) C 30 60 90 120
Z4: Công suất siêu âm (W) D 20 120 140 160
Bảng 4.2.2. Bảng kết quả ma trận kế hoạch thực nghiệm
TT Biến mã hóa Hàm mục tiêu
A B C D Y1 (mg/g) Y2 (mg/g) 1 -1 -1 0 0 11,08 12,86 2 +1 -1 0 0 11,39 14,33 3 -1 +1 0 0 12,73 15,79 4 +1 +1 0 0 12,60 14,86 5 0 0 -1 -1 12,35 15,02 6 0 0 +1 -1 9,68 11,61 7 0 0 -1 +1 12,17 14,87 8 0 0 +1 +1 12,45 15,27 9 -1 0 0 -1 12,06 14,40 10 +1 0 0 -1 12,01 14,43 11 -1 0 0 +1 13,21 15,60
12 +1 0 0 +1 13,26 16,20 13 0 -1 -1 0 11,72 14,69 14 0 +1 -1 0 11,58 15,30 15 0 -1 +1 0 8,87 9,67 16 0 +1 +1 0 11,81 14,01 17 -1 0 -1 0 11,22 13,58 18 +1 0 -1 0 12,74 15,41 19 -1 0 +1 0 12,55 15,18 20 +1 0 +1 0 11,31 13,69 21 0 -1 0 -1 11,93 14,44 22 0 +1 0 -1 10,51 12,72 23 0 -1 0 +1 10,17 12,31 24 0 +1 0 +1 13,26 16,05 25 0 0 0 0 14,39 17,42 26 0 0 0 0 15,21 18,41 27 0 0 0 0 15,20 18,40
4.2.6. Kiểm tra sự tương hợp của mơ hình
Sự tương hợp giữa thực nghiệm và lý thuyết của mơ hình và tìm các hệ số có ý nghĩa được xác định thơng qua việc phân tích hồi quy (ANOVA) của các hàm Y1 (hàm lượng canthaxanthin) và hàm Y2 (hàm lượng carotenoid tổng) được thể hiện ở bảng 4.2.3.
Bảng 4.2.3. Bảng phân tích hồi quy các hàm mục tiêu Y1 và Y2
Nguồn Y1 (mg/g) Y2 (mg/g)
F - Value P - Value F - Value P - Value
Model 22.07 < 0.0001* 17.84 < 0.0001*
A 0.096 0.7620NS 0.034 0.8560NS
B 25.74 0.0003* 22.96 0.0004*
C 12.51 0.0041* 12.47 0.0041*
AC 10.86 0.0064* 8.6 0.0126* AD 0.013 0.9113 NS 0.09 0.7694 NS BC 13.59 0.0031* 8.09 0.0148* BD 29.21 0.0002* 23.12 0.0004* CD 12.49 0.0041* 10.15 0.0078* A2 29.17 0.0002* 22.22 0.0005* B2 127.2 < 0.0001* 98.30 < 0.0001* C2 115.01 < 0.0001* 92.81 < 0.0001* D2 56.73 < 0.0001* 46.41 < 0.0001* R2 0.9626 0.9542 Adj-R2 0.9190 0.9007 Adeq-Precision 18.589 16.489
*p < 0.05: Các giá trị có ý nghĩa; NSp > 0.05: các giá trị khơng có ý nghĩa
Kết quả phân tích của mơ hình ở bảng 4.2.3 cho thấy mơ hình này là hồn tồn tương hợp với thực nghiệm (hay mơ hình là hội tụ) điều này được chứng minh với các chuẩn F (Fisher) của mơ hình có giá trị với hàm Y1 (22.07), Y2 (17.84). Các mơ này có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy cao với các P đều có giá trị (< 0.0001).
Sự phù hợp của mơ hình thực nghiệm cũng được kiểm chứng bằng hệ số xác định R2. Giá trị R2 càng gần 1 thì giá trị thực nghiệm càng gần với giá trị dự đốn của mơ hình. Theo số liệu phân tích ở bảng 4.2.3 hệ số xác định của 2 mơ hình Y1 và Y2 lần lượt có giá trị là 0.9626 (96.26%) và 0.9542 (95.42%), bên cạnh đó giá trị hệ số xác định hiệu chỉnh Adj-R2 của Y1 và Y2 lần lượt có giá trị là 0.9190 (91.90%) và 0.9007 (90.07%) và giá trị Adeq Precision lần lượt là 18.589 và 16.489. Điều này cho thấy giá trị của hàm mục tiêu phụ thuộc vào các biến ảnh hưởng là rất lớn, mơ hình thiết lập là tương hợp với thực nghiệm.
Chúng ta cũng có thể đánh giá sự hội tụ của mơ hình thơng qua các biểu đồ thực nghiệm và dự đoán (predicted and actual value plots) và các biểu đồ phân bố ngẫu nhiên của các lần thí nghiệm (residuals versus runs models) thể hiện ở hình 4.2.5 và hình 4.2.6. Mơ hình có sự tương quan tốt giữa thực nghiệm và lý thuyết khi các điểm thí nghiệm tập trung theo dạng đường chéo thẳng ở mô tả (A) và phân bố của các điểm thí nghiệm là ngẫu nhiên trong phạm vi (-3, 3) ở mô tả (B).
D ự đo án 34.00 30.25
26.50 22.75 19.00
19.60 23.11 26.62 30.13 33.64
Thực tế
Hình 4.2.5. Biểu đồ thực nghiệm và dự đốn, phân bố ngẫu nhiên của hàm Y1
Dự đoán so với thực tế Phần dư và phần hoạt động
Hình 4.2.6. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của hàm Y2
Sau khi loại bỏ các biến khơng có ý nghĩa (p > 0.05) Hàm mục tiêu Y1, Y2 của mơ hình cũng được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:
Y1 = 14.94 + 0.61B – 0,43C + 0.5D – 0.69AC + 0.77BC + 1.13BD + 0.74CD –
0.98A2 – 2.04B2 – 1.94C2 – 1.36D2 (1)
Y2 = 18.07 + 0.79B – 0.58C + 0.64D – 0.83AC + 0.81BC + 1.36BD + 0.9CD –
1.16A2 – 2.44B2 – 2.37C2 – 1.67D2 (2)
Sự ảnh hưởng của các yếu tố tuyến tính (A, B, C, D) đến giá trị hàm mục tiêu là lớn nhất, sau đó là ảnh hưởng của các yếu tố chập (AB, AC, AD, BC, BD, CD) và ảnh hưởng ít nhất đến giá trị hàm mục tiêu là các yếu tố bình phương (A2, B2, C2, D2).
Từ phương trình hồi quy (1) và (2) ta có thể thấy ngay ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng canthaxanthin) và Y2 (hàm lượng carotenoid tổng), có các nhận xét sau”
- Ta thấy chỉ có 3 yếu tố B, C và D ảnh hưởng chính đến hàm Y1 và Y2. Yếu tố A thể hiện mức độ ảnh hưởng yếu hơn thông qua các tương tác chập và tương tác bình phương (AC, A2). P hầ n dư 3.00 1.50 0.00 1 5 9 13 17 21 25 29 Phần hoạt động -1.50 -3.00 36.00 30.00 24.00 18.00 12.00 12.70 18.39 24.07 Thực tế 29.75 35.44 3.00 1.50 0.00 -1.50 -3.00 1 5 9 13 17 21 25 29 Phần hoạt động D ự đo án P hầ n dư
- Trong đó mức độ ảnh hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần B>D>C. Hai yếu tố B và D thì ảnh hưởng đồng biến (tương tác dương) với Y1 và Y2 còn yếu tố C ảnh hưởng nghịch biến (tương tác âm) với Y1 và Y2 tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình hồi quy (1).
Ảnh hưởng của các tương tác cặp yếu tố công nghệ đến các hàm mục tiêu được biểu thị thông qua các bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng biểu diễn 3D ở hình 4.2.7.
(b)
Hình 4.2.7. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin (a) và hàm lượng carotenoid tổng (b)
Trên các bề mặt đáp ứng, vùng màu đỏ sẫm là vùng tối ưu. Tại đó, các giá trị hàm mục tiêu Y1, Y2 nằm trong vùng giá trị lớn nhất. Từ các bề mặt đáp ứng ở hình 4.2.7 có thể đưa ra nhận xét như sau:
Với các bề mặt đáp ứng biểu diễn hàm Y1, và Y2: 3 cặp yếu tố tương tác đôi (BC, BD, CD) ảnh hưởng lớn hơn 3 cặp yếu tố còn lại (AB, AC, AD). Trong 3 cặp yếu tố (BC, BD, CD) thì thứ tự ảnh hưởng mạnh đến hàm Y1 được sắp xếp lần lượt BD > BC > CD. Điều này hoàn phù hợp với kết quả thể hiện ở phương trình hồi quy (1) và (2).
4.2.7. Tối ưu hóa q trình chiết xuất
Q trình chiết xuất sinh khối cần được tối ưu sao cho cả 2 hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng canthaxanthin) và Y2 (hàm lượng carotenoid tổng) đều đạt giá trị lớn nhất. Để thực hiện điều này, tiến hành giải bài toán tối ưu bằng phần mềm Design expert 11.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5). Với các mục tiêu đặt ra là hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng cáo nhất, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau:
+ Hàm lượng canthaxanthin Y1 (mức 4) + Hàm lượng carotenoid tổng Y2 (mức 3)
Kết quả tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0 cho ta 1 giải pháp tương ứng với 1 bộ số liệu công nghệ. Bộ thơng số cơng nghệ tối ưu được trình bày ở bảng 4.2.4 Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.2.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1= 15.07 (mg/g) và Y2=18.26 (mg/g).
Mức độ đáp ứng theo hàm nguyện vọng được thể hiện ở hình 4.2.8. Theo đó với giải pháp này thì đạt được u cầu sau:
- Đối với 4 yếu tố ảnh hưởng đều đạt 100% nguyện vọng - Mục tiêu về hàm canthaxanthin đạt 97.81% nguyện vọng
- Mục tiêu về hàm lượng carotenoid tổng đạt 98.13% nguyện vọng - Nguyện vọng tổng thể đạt 97.94%.
Bảng 4.2.4. Kết quả tối ưu hóa các biến cơng nghệ
Biến mã hóa Biến thực
A B C D Nhiệt độ chiết siêu âm (0C) Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) Thời gian chiết (phút) Công suất chiết siêu âm (W) 0.01 0.23 -0.02 0.27 35 9.5 90 145
Hình 4.2.8. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất
Hình 4.2.9. Điều kiện tối ưu các biến cơng nghệ và kết quả tối ưu hóa hàm mục tiêu Y1 và Y2
Kết quả trên được thực nghiệm lại với quá trình chiết canthaxanthin với quy mơ phịng thí nghiệm được trình bày ở hình sau:
Hình 4.2.10. Thực nghiệm chiết canthaxanthin ứng dụng điều kiện tối ưu hóa trong phịng thí nghiệm
Kết quả thực nghiệm thu được hàm lượng canthanxanthin: 14.9 ± 0.12 (mg/g) và hàm lượng tổng carotenoid: 18.1 ± 0.17 (mg/g) sau quá trình chiết siêu âm đạt xấp xỉ kết quả dự đốn của mơ hình. Sự khác biệt giữa điều kiện thực nghiệm và mơ hình có thể do sự khơng ổn định của các điều kiện chiết xuất.
4.2.8. Kết quả chiết xuất, phân lập canthaxanthin
Kết quả từ 100g bột sinh khối khô ban đầu, trải qua các công đoạn chiết xuất và phân lập đã thu được 125mg canthaxanthin tinh sạch. Các dữ kiện hoá lý cho phép khẳng định hợp chất phân lập được chính là canthaxanthin có độ tinh sạch tới 98.5%.
Hình 4.2.11. Cơng thức hóa học của hợp chất canthaxanthin
Hợp chất này có các thơng số hóa lí sau: + Phổ khối ESI-MS: m/z = 565 [M+H]+
+ Công thức phân tử: C40H52O2 + Trạng thái: chất rắn màu đỏ + Điểm nóng chảy: 2112130C
+ Khả năng hồ tan: Khơng tan trong nước, tan tốt trong acetone, chloroform. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: được xác định trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Brucker 500 MHz tại viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.86 (2H, m, H-2,2’), 2.51 (2H, m, H-3,3’), 6.25 (2H, m, H-7,7’), 6.36 (2H, d, H-8,8’), 6.27 (2H, m, H-10,10’), 6.68 (2H, m, H-11,11’), 6.40 (2H, d, H-12,12’), 6.29 (2H, m, H-14,14’), 6.65 (2H, m, H-15,15’), 1.20 (6H, s, H-16,16’), 1.20 (6H, s, H-17,17’), 1.88 (6H, s, H-18,18’), 2.00 (6H, s, H-19,19’), 2.18 (6H, s, H-20,20’) 13C NMR: δ 198.7 (C=O), 160.9 (C-6,6’), 141.1 (C-8,8’), 139.3 (C-12,12’), 136.6 (C- 13,13’), 134.8 (C-9,9’), 134.3 (C-10,10’), 133.6 (C-14,14’), 130.5 (C-15,15’), 129.9 (C-5,5’), 124.7 (C-11,11’), 124.2 (C-7,7’), 160.9 (C-6,6’), 37.7 (C-2,2’), 35.7 (C-1,1’), 34.3 (C-3,3’), 27.7 (C-16,16’), 27.7 (C-17,17’), 13.7 (C-18,18’), 12.7 (C-20,20’), 12.5 (C-19,19’). Hình 4.2.12. Sắc ký đồ hợp chất canthaxanthin sạch Hình 4.2.13. Canthaxanthin sạch Hình 4.2.14. Sắc ký lớp