TT Biến mã hóa Hàm mục tiêu
A B C D Y1 (mg/g) Y2 (mg/g) 1 -1 -1 0 0 2 +1 -1 0 0 3 -1 +1 0 0 4 +1 +1 0 0 5 0 0 -1 -1 6 0 0 +1 -1 7 0 0 -1 +1 8 0 0 +1 +1 9 -1 0 0 -1 10 +1 0 0 -1 11 -1 0 0 +1 12 +1 0 0 +1 13 0 -1 -1 0 14 0 +1 -1 0 15 0 -1 +1 0 16 0 +1 +1 0 17 -1 0 -1 0 18 +1 0 -1 0 19 -1 0 +1 0
20 +1 0 +1 0 21 0 -1 0 -1 22 0 +1 0 -1 23 0 -1 0 +1 24 0 +1 0 +1 25 0 0 0 0 26 0 0 0 0 27 0 0 0 0
Trong đó, các giá trị biến thực và biến mã hóa tương ứng được thể hiện theo bảng sau:
Bảng 3.2.2. Các mức thí nghiệm của các biến biến cơng nghệ
Biến thực Biến mã Khoảng biến thiên (Δ) Mức nghiên cứu -1 0 1 Z1: Nhiệt độ chiết (0C) A
Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)
B
Z3: Thời gian chiết (phút) C
Z4: Công suất siêu âm (W) D
Các kết quả Y1, Y2 và các giá trị biến thực, biến mã hóa sẽ được tính tốn và thể hiện ở phần kết quả nghiên cứu. Tối ưu hóa các thơng số cơng nghệ của quy trình chiết xuất được thực hiện trên phần mềm Design Expert 7.0.0.
Phương trình hồi quy mô tả mô tả ảnh hưởng của các biến độc lập đối với hàm mục tiêu có dạng hàm đa thức bậc 2 (Hàm mục tiêu Y là chênh lệch khối lượng dầu béo trước và sau phản ứng). Phương trình tổng quát như sau:
Yk = b0 + + + (*)
Trong đó:
Yk: Biến phụ thuộc (k = 1 - 4)
Xi,j : Nhân tố mã hóa của biến độc lập ảnh hưởng đến Yk b0: Hệ số hồi quy thành phần tự do
buj: Hệ số hồi quy(hiệu ứng) tương tác đôi mô tả ảnh hưởng kép của biến Xi và Xj đến Yk
bjj: Hệ số hồi quy (hiệu ứng) bình phương mơ tả ảnh hưởng của biến Xj2 đến Yk
3.3. Đặc điểm và quá trình tổng hợp liposome3.3.1. Quá trình tổng hợp liposome 3.3.1. Quá trình tổng hợp liposome
Canthaxanthin và α-tocopherol được đưa lên liposomes bằng phương pháp bay hơi màng mỏng như đã mô tả trước đây [108]. Hỗn hợp canthaxanthin và α-tocopherol có tỷ lệ khối lượng cố định 1:9 (hỗn hợp A) được hòa tan trong 2ml diclometan cùng với lecithin đậu nành. Các nồng độ ban đầu (IC = mcanthaxanthin/mlipid, %wt/wt) của canthaxanthin được chọn lần lượt là 0.1%; 0.5% và 1.0%. Sau khi hòa tan, màng mỏng thu được bằng cách loại bỏ dung môi hữu cơ trong nồi cách thủy ở 300C dưới áp suất bình 250 mbar và tốc độ quay cấp 2. Nước cất (4ml) được thêm vào để bóc màng, tạo thành liposome có chứa canthaxanthin. Để có được kích thước cố định, liposome được đưa qua màng polycacbonate 100nm trong máy đùn mini 50 lần. Mẫu cuối cùng được đựng trong eppendorf và giữ trong tủ lạnh (khoảng 40C trong bóng tối). Tất cả các mẫu khác (liposome, liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol) được chuẩn bị với cùng một quy trình và tỷ lệ nguyên liệu tương ứng. Cấu trúc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol được thể hiện trong Hình 3.3.1.
Hình 3.3.1. Cấu trúc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol
3.3.2. Kích thước hạt
máy phân tích thế zeta (Horiba, Nhật Bản) với laser He/Ne (λ=633 nm) và tán xạ góc 900. Kết quả thu được là giá trị trung bình của ít nhất ba lần đo.
3.3.3. Q trình đưa canthaxanthin lên liposome
Hiệu suất đóng gói (EE%) và khối lượng tải thuốc (DL%) được xác định bằng máy quang phổ UV-Vis. Canthaxanthin dư thừa đã được loại bỏ bằng thẩm tách (14000Da, 10 cm x 10 cm). Huyền phù được thẩm tách trong 24 giờ với 1 lít nước cất. Nước cất được thay sau mỗi 2 giờ kể từ khi bắt đầu cho 4 lần. Liposome được hòa tan trong 3.5ml hexan và được siêu âm trong 2 phút để phá hủy huyền phù liposome. Sau đó 100 µl hỗn hợp liposome được trộn với 2900µl hexan và được lắc trong 30 giây. Lượng canthaxanthin tự do được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ bằng máy quang phổ Hitachi U-2900 (Hitachi, Tokyo, Nhật Bản) ở bước sóng 474nm với n- hexan làm mẫu đối chứng. (EE%) và (DL%) được xác định tương ứng bằng các phương trình sau:
3.3.4. Thử nghiệm giải phóng thuốc
Lấy 1 ml liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol được đặt vào túi thẩm tách (ngưỡng trọng lượng phân tử =14000 Da), tiếp theo là ủ trong 50ml dung dịch đệm phosphat (PBS) (pH=7.4) có chứa Tween 80 (0.5%) (wt) ở 370C và lắc nhẹ (100 vòng/phút). Sau một khoảng thời gian nhất định, 1ml mẫu được lấy từ túi và một thể tích đệm mới giống hệt được thêm vào. Mơi trường được lấy ra và phân tích bằng cách sử dụng máy quang phổ UV-Vis để tính lượng canthaxanthin được giải phóng. Mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần và được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD).
3.3.5. Thí nghiệm phối trộn liposome vào thức ăn cho cá hồi vân3.3.5.1. Cá và chế độ ăn 3.3.5.1. Cá và chế độ ăn
Ảnh hưởng của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol trong chế độ ăn bổ sung cho cá hồi vân đã được khảo sát tại Trung tâm Nghiên cứu Cá nước lạnh Sa Pa, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản (Lào Cai, Việt Nam). Tổng cộng có 900 con cá được cân riêng và phân bổ ngẫu nhiên vào 30 bể (mỗi bể 280 lít). Mỗi bể chứa 30 con cá và mỗi lần nhân rộng bao gồm 10 bể. Một tháng trước khi bổ sung chế độ ăn
uống, cá được ni với thức ăn khơng có màu để màu cơ của chúng trở lại màu ban đầu. Sau đó, mỗi bể trong mỗi nhóm được cho ăn một trong mười khẩu phần thí nghiệm trong 3 tháng (Bảng 3.3.1). Thức ăn thơ sử dụng trong thí nghiệm do Nhà máy thức ăn chăn ni Kinh Bắc, tỉnh Bắc Ninh, Việt Nam sản xuất với thành phần dinh dưỡng cơ bản như sau: đạm 40%, chất béo 18%, chất xơ thô 5%, năng lượng 3800kcal/kg. Cá được cho ăn lúc 6 giờ sáng, 10 giờ sáng, 2 giờ chiều và 6 giờ chiều hàng ngày cho đến khi no. Nước trong bể được thay liên tục bằng nước ngọt với tốc độ 4l/phút. Nhiệt độ nước và oxy hòa tan được duy trì trong khoảng từ 6 đến 17.50C và từ 10 đến 11ppm tương ứng. Máy bơm khơng khí được sử dụng để sục khí vào nước.
Bảng 3.3.1. Thành phần thức ăn cho cá được sử dụng trong thử nghiệm
Khẩu phần dinh dưỡng
Khối lượng (mg)
Lecithin tocopherolα- Canthaxanthin
Chế độ I Khẩu phần thức ăn thương mại - - -
Chế độ II Khẩu phần thức ăn thương mại
bổ sung 1g/kg lecithin 1000 - -
Chế độ III Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α-tocopherol
- 100 -
Chế độ IV Khẩu phần thức ăn thương mại
bổ sung 20mg/kg canthaxanthin - - 20
Chế độ V Khẩu phần thức ăn thương mại
bổ sung 100mg/kg α-tocopherol và 20mg/kg canthaxanthin
- 100 20
Chế độ VI Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1 g/kg α-tocopherol loaded liposomes
990 10 -
Chế độ VII
Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin trên liposomes (IC=1%)
990 - 10
Chế độ
VIII Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes (IC=0.1%)
990 9 1
Chế độ IX Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes (IC=0.5%)
950 45 5
Chế độ X Khẩu phần thức ăn thương mại
bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes
3.3.5.2. Tiến hành đo khối lượng
Trong quá trình thử nghiệm, cá được cân định kỳ hàng tháng bằng cách lấy trọng lượng trung bình của ba con cá được bắt ngẫu nhiên từ mỗi nhóm. Các chỉ số sinh trưởng của cá được xác định như sau:
Trọng lượng tăng (WG, %) = (Wf - Wi)/Wi) × 100
Tốc độ tăng trưởng cụ thể (SGR) g/ngày = 100 (ln Wf - ln Wi)/t Trong đó:
Wf là trọng lượng cơ thể cuối cùng (g), Wi là trọng lượng cơ thể ban đầu (g) và t là thời gian thí nghiệm (ngày).
3.3.5.3. Xác định thành phần canthaxanthin trong cơ của cá hồi
Sau ba tháng với chế độ ăn thử nghiệm, phi lê cá được thu thập và đo màu bằng máy so màu Salmofan Lineal (DSM Nutritional Products, Kaiseraugst, Thụy Sĩ) trên thang điểm từ 20 đến 34, đây là tiêu chuẩn quốc tế được chấp nhận cho màu cá hồi (Hình 3.3.2). Điểm số được ghi lại cho mỗi mẫu được ba nhà nghiên cứu thống nhất.
Hình 3.3.2. Máy đo màu DSM SalmoFan
Sự phân bố canthaxanthin trong mô cơ của cá được xác định như sau. Đầu tiên, các mẫu cơ được thu thập trên lưng cá và bảo quản ở -200C. Sau đó, canthaxanthin được chiết xuất theo quy trình được mơ tả trước đó. Tóm lại, sau khi được nghiền bằng thiết bị đồng nhất ULTRA-TURRAX® của IKA, các mẫu được chiết xuất bằng dung mơi hữu cơ, sau đó làm sạch và phân tích bằng máy sắc ký HPLC với chất chuẩn canthaxanthin của Sigma Aldrich. Hệ thống sắc ký khí lỏng sử dụng cột phân tích C- 18 Hypersil Gold (5 µm, 150mm x 4.6 mm), tốc độ dòng được cài đặt 1ml/phút. Thời gian lưu là 6 phút. Quy trình được thực hiện tại phịng phân tích của Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1. Tối ưu quá trình lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn 4.1. Tối ưu quá trình lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn 4.1.1. Khảo sát thành phần mơi trường sinh tổng hợp canthaxanthin
Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin bởi vi khuẩn P.carotinifaciens. Các thành phần môi trường và nồng độ mỗi thành phần được khảo sát, đánh giá gồm, cơ chất carbon, cơ chất nitơ, hợp chất trung gian thuộc chu trình Kreb chuyển hóa beta carotene thành canthaxanthin; vitamin, acid amin và muối khoáng được lựa chọn dựa trên các kết quả nghiên cứu của Cyplik; Bhosale; Nasri và Tanaka [104]; [33]. Kết quả khảo sát, chọn miền khảo sát sử dụng trong tối ưu hóa thành phần mơi trường lên men sinh tổng hợp canthaxanthin được trình bày sau.
Hình 4.1.1. Ảnh hưởng của cơ chất carbon và nitơ đến sự sinh tổng hợp canthanaxanthin của vi khuẩn P.carotinifaciens VTP 20181
- Đối với cơ chất carbon cho thấy mẫu thí nghiệm sử dụng sucrose có sản lượng canthaxanthin cao nhất so với mẫu đối chứng.
- Đối với nguồn nitơ hữu cơ và vơ cơ, mẫu thí nghiệm sử dụng NH4SO4 có sản lượng canthaxanthin cao nhất so với mẫu đối chứng.
Kết quả này phù hợp với công bố của Cyplik và Tsuboka [104] về khả năng đồng hóa các cơ chất carbon, nitơ của chủng P.carotinifaciens VTP 20181. Chế phẩm từ nấm men chứng tỏ là nguồn cơ chất thích hợp cung cấp chất dinh dưỡng, vitamin, acid amin, các thành phần vi lượng cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn thích hợp hơn các nguồn cơ chất nitơ khác. Đánh giá về tính kinh tế và khả năng ứng dụng sản xuất canthaxanthin quy mơ cơng nghiệp, nhóm nghiên cứu lựa chọn sucrose là cơ chất carbon và cơ chất nitơ là NH4SO4 và bột nấm men trong các thí nghiệm tối ưu hóa tiếp
Hình 4.1.2. Ảnh hưởng của hợp chất trung gian, vitamin và acid amin đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181
Các nghiên cứu của Misawa [109] cho thấy canthaxanthin được sinh tổng hợp bởi chủng Paracoccus theo chu trình Krebs. Kết quả nghiên cứu của Misawa và Chougle chứng tỏ các hợp chất trung gian như malate, citrate, acetate, succinate, fumarate…thúc đẩy sinh tổng hợp beta carotene, gián tiếp thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các hợp chất xanthophyll carotene như astaxanthin, canthaxanthin, zeaxanthin… [104; 110].
- Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của các hợp chất trung gian đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181, mẫu thí nghiệm bổ sung malate có hàm lượng canthaxanthin và sinh khối cao nhất so với mẫu đối chứng.
- Các kết quả đánh giá ảnh hưởng của vitamin và acid amin đối với sự sinh tổng hợp canthaxanthin bằng P.carotinifaciens VTP20181 cho thấy Biotin và glutamate là hai tác nhân có ảnh hưởng lớn nhất đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất của
P.carotinifaciens VTP 20181 lần lượt đối với nhóm vitamin và acid amin.
Kết quả này phù hợp với công bố của Cyplik và cộng sự [104] nghiên cứu về ảnh hưởng của Biotin đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất của P.carotinifaciens và nghiên cứu của Misawa và cộng sự [109], đánh giá ảnh hưởng của glutamate trên P.
carotinifaciens đột biến sinh tổng hợp canthaxanthin.
Hình 4.1.3. Ảnh hưởng của hợp chất vô cơ đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181
Các ion kim loại là tác nhân quan trọng đối với sự phát triển và sinh tổng hợp hoạt chất sinh học của vi khuẩn ưa muối, sử dụng nitrate, nitrite cho quá trình hơ hấp [110]. Kết quả khảo sát cho thấy K, Fe, Co và Mg có hàm lượng canthaxanthin và hiệu suất sinh tổng hợp canthaxanthin cao nhất so với mẫu đối chứng, được lựa chọn sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 4.1.1. Đánh giá nồng độ NaCl đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của chủng vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181
Nồng độ NaCl Đơn vị P.carotinifaciens VTP 20181
17.5 g/l + 50 g/l ± 100 g/l - 150 g/l - 200 g/l - 250 g/l - 300 g/l - 350 g/l -
(Ghi chú: - không phát triển, ± phát triển yếu, + phát triển. Tế bào chết được xác định bằng nhuộm xanh methylen, đếm tế bào chết bằng buồng đếm hồng cầu)
Từ bảng 4.1.1 cho thấy để chủng vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181 phát triển tốt cần mơi trường có hàm lượng muối NaCl 17.5g/l.
Từ các kết quả khảo sát trên, tiến hành các thí nghiệm tìm hàm lượng tối ưu của thành phần môi trường: NH4SO4, KH2PO4, MgSO4, Biotin, monosodium glutamate, CoCl2, FeSO4, bột nấm men, Sucrose, Sodium malate, và NaCl đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin:
Hình 4.1.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181
Từ kết quả khảo sát các thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp canthaxanthin chúng tôi lựa chọn thành phần môi trường như bảng 4.1.2:
Bảng 4.1.2. Thành phần môi trường
STT Thành phần môi trường
Nồng độ
Môi trường sinh tổng hợp canthaxanthin (YTN) 1 NH4SO4 (g/l) 0.8 2 KH2PO4 (g/l) 4.5 3 MgSO4 (g/l) 1 4 Biotin (g/l) 0.1 5 Monosodium Glutamate (g/l) 6.47 6 CoCl2 (mg/l) 2 7 FeSO4 (g/l) 1 8 Bột nấm men (g/l) 30 9 Sucrose (g/l) 17.5 10 Sodium malate (g/l) 1.89 11 NaCl (g/l) 17.5 12 Canthaxanthin dự đoán (mg/g) 7.82
13 Sinh khối dự đốn (g/l) 12.12
Nhóm nghiên cứu tiến hành thực nghiệm lên men sinh tổng hợp canthaxannthin bằng chủng P.carotinifaciens VTP20181 sử dụng các công thức môi trường đề xuất
thu được từ kết quả với thể tích dịch lên men 3 lít, nhiệt độ 280C, pH=7, thời gian lên men 48h. Kết quả thực nghiệm được trình bày ở hình sau:
Hình 4.1.5. Thực nghiệm lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
Biểu đồ trên cho thấy sản lượng canthaxanthin sinh tổng hợp bằng
P.carotinifaciens VTP20181 trên mơi trường YTN có kết quả xấp xỉ theo tính tốn, với
hàm lượng canthaxanthin trung bình đạt 7.62 mg/g sinh khối khô, hàm lượng sinh khối đạt 11.9 g sinh khối khơ/lít.
4.1.2. Nghiên cứu tối ưu điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin
4.1.2.1. Sàng lọc mức ảnh hưởng của điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
Nhóm nghiên cứu tiến hành tìm tâm thí nghiệm khảo sát các điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin bởi chủng P.carotinifaciens VTP20181. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở hình sau:
Hình 4.1.6. Ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin
Kết quả thu được cho thấy điều kiện thích hợp sinh tổng hợp canthaxanthin bởi
P.carotinifaciens VTP20181 là pH 7÷8; nhiệt độ từ 25300C; tỷ lệ giống từ 0.75÷1%; tốc độ lắc từ 100300 rpm; thời gian từ 60÷72 giờ. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đó về P.carotinifaciens của Martín [110].
Mức độ ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181 được sàng lọc và đánh giá sơ bộ trên ma trận Factorial Min-Run Resolution IV với 2 mức thí nghiệm thấp và cao sử dụng tâm thí nghiệm đã khảo sát ở thí nghiệm trước đó. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng sau:
Bảng 4.1.3. Ma trận Min Run Screening và mức ảnh hưởng đến hàm đáp ứng Cx và Biomass
Tham số Cx (mg/g) Biomass (g/l)
F-value p-value Coefficient F-value p-value Coefficient
Model 305.15 <0.0001 696.69 99.57 < 0.0001 9.42 A - pH 88.04 < 0.0001 - 44.42 425.48 < 0.0001 3.33 B - Nhiệt độ 515.09 < 0.0001 110.97 18.37 0.0052 0.7150 C - Thời gian 103.61 < 0.0001 - 49.77 8.4152 0.0432 0.8075