CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM
3.1. Lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn
3.1.4. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
Từ kết quả sàng lọc bằng ma trận, các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181 được xác định giá trị tối ưu và đánh giá ở 5 mức (-α; -1; 0; +1; +α) trong CCD. Số liệu được phân tích bằng chương trình Design Expert 7.0.0 của Cơng ty Stat-Ease, Inc.USA. Đối với số yếu tố công nghệ là 5 (k=5), ta xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm như bảng sau:
Bảng 3.1.4. Bố trí ma trận kế hoạch thực nghiệmSTT A B C D E Y1 (mg/g) Y2 (mg Cx/l) STT A B C D E Y1 (mg/g) Y2 (mg Cx/l) 1 -1 -1 -1 -1 +1 2 +1 -1 -1 -1 -1 3 -1 +1 -1 -1 -1 4 +1 +1 -1 -1 +1 5 -1 -1 +1 -1 -1 6 +1 -1 +1 -1 +1 7 -1 +1 +1 -1 +1 8 +1 +1 +1 -1 -1 9 -1 -1 -1 +1 -1 10 +1 -1 -1 +1 +1 11 -1 +1 -1 +1 +1 12 +1 +1 -1 +1 -1 13 -1 -1 +1 +1 +1 14 +1 -1 +1 +1 -1 15 -1 +1 +1 +1 -1 16 +1 +1 +1 +1 +1 17 - α 0 0 0 0 18 + α 0 0 0 0 19 0 -α 0 0 0 20 0 + α 0 0 0 21 0 0 -α 0 0 22 0 0 + α 0 0 23 0 0 0 -α 0 24 0 0 0 + α 0 25 0 0 0 0 -α 26 0 0 0 0 + α 27 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 29 0 0 0 0 0 30 0 0 0 0 0 31 0 0 0 0 0 32 0 0 0 0 0
Trong đó Y1 (Cx) là hàm lượng canthaxanthin (mg/g) và Y2 là hiệu suất tạo Canthaxanthin (mgCx/l).
Từ kết quả phân tích xác định mức tối ưu của các yếu tố cho sản lượng canthanxanthin cực đại. Giá trị hàm đáp ứng theo thực nghiệm và tiên đốn theo mơ hình được đánh giá qua phân tích phương sai ANOVA. Phương trình hồi quy được dùng như mơ hình tiên đốn hàm lượng canthaxanthin, hàm lượng sinh khối và sản lượng hoạt chất thu được.
3.1.5. Lựa chọn mơ hình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
- Lựa chọn mơ hình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin phù hợp, đáp ứng yêu cầu về kinh tế, khả năng ứng dụng ở quy mô cơng nghiệp, sản lượng canthaxanthin cao.
Tiến hành: Các mơ hình lên men được thiết lập theo kết quả nghiên cứu của Zhang và Bae [106; 107].
Lên men theo mẻ: lên men trên môi trường YTN, thời gian lên men 72h.
Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất: lên men 24 h sau đó bổ sung cơ chất tại các thời điểm: 24h (+5g/l sucrose); 36h (+5g/l sucrose), 48h (+5g sucrose, 5g bột nấm men), 60h (+5g sucrose, 5g bột nấm men) và 72h (+5g sucrose, 5g bột nấm men). Quá trình lên men kết thúc sau 92h.
Lên men liên tục: lên men 24 h sau đó bổ sung cơ chất với nồng độ (0.52g sucrose + 0.32g bột nấm men/h trong 48h. Quá trình lên men kết thúc sau 92h.
Các thông số đánh giá quá trình lên men gồm: Hàm lượng canthaxanthin (mg/g), hàm lượng sinh khối (g/l), năng suất sinh tổng hợp canthaxanthin (mgCx/l), năng suất sinh tổng hợp canthaxanthin (mgCx/l.h).
Thí nghiệm lựa chọn điều kiện tối ưu sinh tổng hợp canthaxanthin trên mơ hình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất được thực hiện như sau:
Bảng 3.1.5. Lựa chọn điều kiện tối ưu sinh tổng hợp canthaxanthin
Thí nghiệm Số lần bổ sung Hàm lượng cơ chất bổ sung (g/lần) Thời gian bổ sung (h) Ghi chú Bổ sung sucrose 3 3g/lần; 4g/lần; 5g/lần, 6g/lần 35h, 45h Cố định: số lần bổ sung, thời gian bổ sung, thông số đánh giá:
Cx (mg/g), Biomass(g/l)
bột nấm men
5g/lần, 6g/lần gian bổ sung, thông số đánh giá:
Cx (mg/g), Biomass(g/l)
Số lần bổ sung
2 5g sucrose, 6g
bột nấm men 30h, 45h sung; 6g bột nấm men/lần bổCố định: 5g sucrose/lần bổ sung. Không bổ sung bột nấm men thời điểm 24h. Thông số đánh giá: Cx (mg/g); Biomass (g/l) 3 5g sucrose, 6g bột nấm men 24h, 36h, 48h 4 5g sucrose, 6g bột nấm men 24h, 35h, 45h, 55h
3.1.6. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men
Mục đích: lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối vi sinh vật sau lên men.
Bảng 3.1.6. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men
Thí nghiệm Điều kiện thí nghiệm Thơng số đánh giá
Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối
- Lắng, ly tâm: lắng sinh khối ở 40C/24h, ly tâm 10000 rpm, thiết bị ly tâm CEPA, Đức. - Lọc màng: khe lọc 0,6nm, tốc độ dịch:180-200l/h - Ly tâm bán liên tục: tốc độ ly tâm: 15000 rpm, tốc độ dịch: 600l/h
Hiệu suất thu nhận sinh khối
Lựa chọn tốc độ ly tâm
10000, 12000, 15000, 17000 rpm Hiệu suất thu nhận sinh
khối Tỷ lệ sinh khối/nước
rửa sinh khối (m/V)
1 /2; 1 /3; 1 /4; 1 /5; 1 /6 Hiệu suất thu nhận sinh khối, Bx dịch rửa
Số lần rửa 1 lần, 2 lần, 3 lần Hiệu suất thu nhận sinh
khối, Bx dịch rửa Tỷ lệ nước bổ sung
vào sinh khối trước sấy phun
1/1; 1/2; 1/3 Hiệu suất thu hồi chế
phẩm, hàm lượng Cx, cảm quan chế phẩm
Chế độ sấy 1550C/800C /2l/h/20000rpm;
1650C/850C /2.5l/h/20000rpm; 1750C/900C /2.5l/h/20000rpm;
Hiệu suất thu hồi chế phẩm, hàm lượng Cx, cảm quan chế phẩm
3.2. Xây dựng quy trình chiết xuất canthaxanthin
Bột sinh khối khô 100(g) được chiết xuất với dung mơi ethanol 96% có bổ sung 0.5% chất hoạt động bề mặt Glycerol Monostearate (GMS). Bốn thông số công nghệ của quá trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối được khảo sát để đưa ra điều kiện tối ưu gồm: nhiệt độ chiết (0C), tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w), thời gian chiết (phút) và công suất siêu âm (W). Sau khi chiết xuất, dịch chiết được cô quay đuổi dung môi ta thu được cao chiết tổng. Hàm lượng carotenoid tổng và hàm lượng canthaxanthin được xác định lần lượt bằng phương pháp đo quang và phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Kết quả hàm lượng carotenoid tổng và canthaxanthin xác định được từ cao chiết tổng được sử dụng làm hàm mục tiêu để tối ưu quá trình chiết xuất.
Cao chiết tổng thu được ở quá trình chiết xuất tiếp tục được xử lý loại tạp chất béo bão hòa bằng phương pháp kết tinh ure sau đó tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexan/acetone (4/1, v/v) để phân lập canthaxanthin. Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) để kiểm tra các phân đoạn thu được trong quá trình sắc ký cột, gom các phân đoạn có chứa hợp chất canthaxanthin sạch. Cơ quay đuổi dung môi ta thu được hợp chất canthaxanthin độ tinh sạch trên 98%. Tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR của chất sạch phân lập được. So sánh với tài liệu tham khảo để khẳng định hợp chất thu được chính là canthaxanthin.
3.2.1. Định lượng canthaxanthin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
Dựa vào phương trình đường chuẩn thể hiện mối liên hệ tương quan giữa nồng độ canthaxanthin chuẩn và diện tích peak đã được xây dựng tại Phịng Phân tích Hóa học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên để xác định nồng độ canthaxanthin trong các mẫu cao chiết tổng cần phân tích.
Đồ thị đường chuẩn được biểu diễn trên hình 3.2.1. Phương trình đường chuẩn có dạng: Y =12389X + 453 với R2 = 0.9979.
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố cơng nghệ đến hiệu suất q trìnhchiết xuất canthaxanthin chiết xuất canthaxanthin
Bốn thông số công nghệ gồm nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu và công suất siêu âm sẽ được khảo sát đơn biến và đánh giá, lựa chọn điều kiện phù hợp bằng hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng trong cao chiết.
Trong đó:
+ Hàm lượng canthaxanthin (mg/g) = + Hàm lượng carotenoid tổng (mg/g)
Dựa trên một số khảo sát sơ bộ ban đầu, chúng tôi lựa chọn các mức cơ bản (mức gốc) cho các yếu tố công nghệ như sau:
+ Nhiệt độ chiết: 35 (0C)
+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 9/1 (v/w) + Thời gian chiết: 90 (phút)
+ Công suất siêu âm: 160 (W)
Khi khảo sát sự phụ thuộc của từng biến độc lập thì 3 biến cịn lại được giữ cố định ở các mức gốc hoặc mức tốt nhất ở khảo sát trước đó, biến được khảo sát sẽ được thử nghiệm ở các điều kiện khác nhau để lựa chọn điều kiện thích hợp nhất.
3.2.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết
Nhiệt độ chiết xuất được khảo sát ở các mức 300C, 350C, 400C, 450C và 500C. Các biến độc lập còn lại được cố định là:
+ Thời gian chiết: 90 phút
+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w): 9/1 + Công suất siêu âm: 160 W
+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam
+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS
Nhiệt độ chiết cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi/ngun liệu đến q trình chiết
Tỷ lệ dung mơi/ngun liệu (v/w) được khảo sát ở các tỷ lệ: 5/1; 7/1; 9/1; 11/ và 13/1. Ba biến độc lập còn lại được cố định là:
+ Nhiệt độ chiết: 350C + Thời gian chiết: 90 phút + Công suất siêu âm: 160 W
+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam
+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu chiết cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết
Thời gian chiết xuất được khảo sát ở các mức 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và 150 phút. Ba biến độc lập còn lại được cố định là:
+ Nhiệt độ chiết: 350C
+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w): 9/1 + Công suất siêu âm: 160 W
+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam
+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS
Thời gian chiết cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của cơng suất siêu âm đến q trình chiết
Cơng suất siêu âm được khảo sát ở các mức: 100 W, 120 W, 140 W, 160 W và 180 W. Ba biến độc lập còn lại được cố định là:
+ Thời gian chiết: 90 phút
+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w): 9/1 + Nhiệt độ chiết: 350C
+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam.
+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS
Công suất siêu âm cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Xây dựng mơ hình nghiên cứu và ma trận kế hoạch thực nghiệm
Các thông số công nghệ sau khi khảo sát đã lựa chọn được các thông số tốt nhất. Dựa vào các thông số này, nhóm nghiên cứu tiếp tục xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm để tìm thơng số tối ưu cho quá trình chiết xuất. Sử dụng kế hoạch bậc 2 của Box-Behnken để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm. Trong đó Z1, Z2, Z3, Z4 là
các biến thực; A, B, C, D tương ứng là các biến mã hóa; Y1(mg/g) là hàm mục tiêu thể hiện hàm lượng canthaxanthin trong cao chiết tổng và Y2(mg/g) là hàm mục tiêu thể hiện hàm lượng carotenoid tổng trong cao chiết. Y1 và Y2 càng lớn chứng tỏ hiệu suất quá trình chiết xuất là tốt. Thực hiện 27 thí nghiệm theo ma trận kế hoạch dưới đây:
Bảng 3.2.1. Bảng ma trận kế hoạch thực nghiệm
TT Biến mã hóa Hàm mục tiêu
A B C D Y1 (mg/g) Y2 (mg/g) 1 -1 -1 0 0 2 +1 -1 0 0 3 -1 +1 0 0 4 +1 +1 0 0 5 0 0 -1 -1 6 0 0 +1 -1 7 0 0 -1 +1 8 0 0 +1 +1 9 -1 0 0 -1 10 +1 0 0 -1 11 -1 0 0 +1 12 +1 0 0 +1 13 0 -1 -1 0 14 0 +1 -1 0 15 0 -1 +1 0 16 0 +1 +1 0 17 -1 0 -1 0 18 +1 0 -1 0 19 -1 0 +1 0 20 +1 0 +1 0
21 0 -1 0 -1 22 0 +1 0 -1 23 0 -1 0 +1 24 0 +1 0 +1 25 0 0 0 0 26 0 0 0 0 27 0 0 0 0
Trong đó, các giá trị biến thực và biến mã hóa tương ứng được thể hiện theo bảng sau:
Bảng 3.2.2. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ
Biến thực Biến mã Khoảng biến thiên (Δ) Mức nghiên cứu -1 0 1 Z1: Nhiệt độ chiết (0C) A
Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)
B
Z3: Thời gian chiết (phút) C
Z4: Công suất siêu âm (W) D
Các kết quả Y1, Y2 và các giá trị biến thực, biến mã hóa sẽ được tính tốn và thể hiện ở phần kết quả nghiên cứu. Tối ưu hóa các thơng số cơng nghệ của quy trình chiết xuất được thực hiện trên phần mềm Design Expert 7.0.0.
Phương trình hồi quy mơ tả mơ tả ảnh hưởng của các biến độc lập đối với hàm mục tiêu có dạng hàm đa thức bậc 2 (Hàm mục tiêu Y là chênh lệch khối lượng dầu béo trước và sau phản ứng). Phương trình tổng quát như sau:
Yk = b0 + + + (*)
Trong đó:
Yk: Biến phụ thuộc (k = 1 - 4)
Xi,j : Nhân tố mã hóa của biến độc lập ảnh hưởng đến Yk b0: Hệ số hồi quy thành phần tự do
buj: Hệ số hồi quy(hiệu ứng) tương tác đôi mô tả ảnh hưởng kép của biến Xi và Xj đến Yk
bjj: Hệ số hồi quy (hiệu ứng) bình phương mơ tả ảnh hưởng của biến Xj2 đến Yk
3.3. Đặc điểm và quá trình tổng hợp liposome3.3.1. Quá trình tổng hợp liposome 3.3.1. Quá trình tổng hợp liposome
Canthaxanthin và α-tocopherol được đưa lên liposomes bằng phương pháp bay hơi màng mỏng như đã mô tả trước đây [108]. Hỗn hợp canthaxanthin và α-tocopherol có tỷ lệ khối lượng cố định 1:9 (hỗn hợp A) được hòa tan trong 2ml diclometan cùng với lecithin đậu nành. Các nồng độ ban đầu (IC = mcanthaxanthin/mlipid, %wt/wt) của canthaxanthin được chọn lần lượt là 0.1%; 0.5% và 1.0%. Sau khi hòa tan, màng mỏng thu được bằng cách loại bỏ dung môi hữu cơ trong nồi cách thủy ở 300C dưới áp suất bình 250 mbar và tốc độ quay cấp 2. Nước cất (4ml) được thêm vào để bóc màng, tạo thành liposome có chứa canthaxanthin. Để có được kích thước cố định, liposome được đưa qua màng polycacbonate 100nm trong máy đùn mini 50 lần. Mẫu cuối cùng được đựng trong eppendorf và giữ trong tủ lạnh (khoảng 40C trong bóng tối). Tất cả các mẫu khác (liposome, liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol) được chuẩn bị với cùng một quy trình và tỷ lệ nguyên liệu tương ứng. Cấu trúc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol được thể hiện trong Hình 3.3.1.
Hình 3.3.1. Cấu trúc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol
3.3.2. Kích thước hạt
Chỉ số z trung bình, kích thước trung bình và chỉ số phân tán (PDI) của các mẫu liposome được theo dõi bằng cách sử dụng máy đo kích thước hạt nano SZ-100 và
máy phân tích thế zeta (Horiba, Nhật Bản) với laser He/Ne (λ=633 nm) và tán xạ góc 900. Kết quả thu được là giá trị trung bình của ít nhất ba lần đo.
3.3.3. Q trình đưa canthaxanthin lên liposome
Hiệu suất đóng gói (EE%) và khối lượng tải thuốc (DL%) được xác định bằng máy quang phổ UV-Vis. Canthaxanthin dư thừa đã được loại bỏ bằng thẩm tách (14000Da, 10 cm x 10 cm). Huyền phù được thẩm tách trong 24 giờ với 1 lít nước cất. Nước cất được thay sau mỗi 2 giờ kể từ khi bắt đầu cho 4 lần. Liposome được hòa tan trong 3.5ml hexan và được siêu âm trong 2 phút để phá hủy huyền phù liposome. Sau đó 100 µl hỗn hợp liposome được trộn với 2900µl hexan và được lắc trong 30 giây. Lượng canthaxanthin tự do được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ bằng máy quang phổ Hitachi U-2900 (Hitachi, Tokyo, Nhật Bản) ở bước sóng 474nm với n- hexan làm mẫu đối chứng. (EE%) và (DL%) được xác định tương ứng bằng các phương trình sau:
3.3.4. Thử nghiệm giải phóng thuốc
Lấy 1 ml liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol được đặt vào túi thẩm tách (ngưỡng trọng lượng phân tử =14000 Da), tiếp theo là ủ trong 50ml dung dịch đệm phosphat (PBS) (pH=7.4) có chứa Tween 80 (0.5%) (wt) ở 370C và lắc nhẹ (100 vòng/phút). Sau một khoảng thời gian nhất định, 1ml mẫu được lấy từ túi và một thể tích đệm mới giống hệt được thêm vào. Mơi trường được lấy ra và phân tích bằng cách sử dụng máy quang phổ UV-Vis để tính lượng canthaxanthin được giải phóng. Mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần và được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch