CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM
3.2. Xây dựng quy trình chiết xuất canthaxanthin
Bột sinh khối khô 100(g) được chiết xuất với dung mơi ethanol 96% có bổ sung 0.5% chất hoạt động bề mặt Glycerol Monostearate (GMS). Bốn thông số công nghệ của quá trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối được khảo sát để đưa ra điều kiện tối ưu gồm: nhiệt độ chiết (0C), tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w), thời gian chiết (phút) và công suất siêu âm (W). Sau khi chiết xuất, dịch chiết được cô quay đuổi dung môi ta thu được cao chiết tổng. Hàm lượng carotenoid tổng và hàm lượng canthaxanthin được xác định lần lượt bằng phương pháp đo quang và phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Kết quả hàm lượng carotenoid tổng và canthaxanthin xác định được từ cao chiết tổng được sử dụng làm hàm mục tiêu để tối ưu quá trình chiết xuất.
Cao chiết tổng thu được ở quá trình chiết xuất tiếp tục được xử lý loại tạp chất béo bão hòa bằng phương pháp kết tinh ure sau đó tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexan/acetone (4/1, v/v) để phân lập canthaxanthin. Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) để kiểm tra các phân đoạn thu được trong quá trình sắc ký cột, gom các phân đoạn có chứa hợp chất canthaxanthin sạch. Cơ quay đuổi dung môi ta thu được hợp chất canthaxanthin độ tinh sạch trên 98%. Tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR của chất sạch phân lập được. So sánh với tài liệu tham khảo để khẳng định hợp chất thu được chính là canthaxanthin.
3.2.1. Định lượng canthaxanthin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
Dựa vào phương trình đường chuẩn thể hiện mối liên hệ tương quan giữa nồng độ canthaxanthin chuẩn và diện tích peak đã được xây dựng tại Phịng Phân tích Hóa học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên để xác định nồng độ canthaxanthin trong các mẫu cao chiết tổng cần phân tích.
Đồ thị đường chuẩn được biểu diễn trên hình 3.2.1. Phương trình đường chuẩn có dạng: Y =12389X + 453 với R2 = 0.9979.
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố cơng nghệ đến hiệu suất q trìnhchiết xuất canthaxanthin chiết xuất canthaxanthin
Bốn thông số công nghệ gồm nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu và công suất siêu âm sẽ được khảo sát đơn biến và đánh giá, lựa chọn điều kiện phù hợp bằng hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng trong cao chiết.
Trong đó:
+ Hàm lượng canthaxanthin (mg/g) = + Hàm lượng carotenoid tổng (mg/g)
Dựa trên một số khảo sát sơ bộ ban đầu, chúng tôi lựa chọn các mức cơ bản (mức gốc) cho các yếu tố công nghệ như sau:
+ Nhiệt độ chiết: 35 (0C)
+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 9/1 (v/w) + Thời gian chiết: 90 (phút)
+ Công suất siêu âm: 160 (W)
Khi khảo sát sự phụ thuộc của từng biến độc lập thì 3 biến cịn lại được giữ cố định ở các mức gốc hoặc mức tốt nhất ở khảo sát trước đó, biến được khảo sát sẽ được thử nghiệm ở các điều kiện khác nhau để lựa chọn điều kiện thích hợp nhất.
3.2.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết
Nhiệt độ chiết xuất được khảo sát ở các mức 300C, 350C, 400C, 450C và 500C. Các biến độc lập còn lại được cố định là:
+ Thời gian chiết: 90 phút
+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w): 9/1 + Công suất siêu âm: 160 W
+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam
+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS
Nhiệt độ chiết cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi/ngun liệu đến q trình chiết
Tỷ lệ dung mơi/ngun liệu (v/w) được khảo sát ở các tỷ lệ: 5/1; 7/1; 9/1; 11/ và 13/1. Ba biến độc lập còn lại được cố định là:
+ Nhiệt độ chiết: 350C + Thời gian chiết: 90 phút + Công suất siêu âm: 160 W
+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam
+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu chiết cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết
Thời gian chiết xuất được khảo sát ở các mức 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và 150 phút. Ba biến độc lập còn lại được cố định là:
+ Nhiệt độ chiết: 350C
+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w): 9/1 + Công suất siêu âm: 160 W
+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam
+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS
Thời gian chiết cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của cơng suất siêu âm đến q trình chiết
Cơng suất siêu âm được khảo sát ở các mức: 100 W, 120 W, 140 W, 160 W và 180 W. Ba biến độc lập còn lại được cố định là:
+ Thời gian chiết: 90 phút
+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w): 9/1 + Nhiệt độ chiết: 350C
+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam.
+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS
Công suất siêu âm cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Xây dựng mơ hình nghiên cứu và ma trận kế hoạch thực nghiệm
Các thông số công nghệ sau khi khảo sát đã lựa chọn được các thông số tốt nhất. Dựa vào các thông số này, nhóm nghiên cứu tiếp tục xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm để tìm thơng số tối ưu cho quá trình chiết xuất. Sử dụng kế hoạch bậc 2 của Box-Behnken để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm. Trong đó Z1, Z2, Z3, Z4 là
các biến thực; A, B, C, D tương ứng là các biến mã hóa; Y1(mg/g) là hàm mục tiêu thể hiện hàm lượng canthaxanthin trong cao chiết tổng và Y2(mg/g) là hàm mục tiêu thể hiện hàm lượng carotenoid tổng trong cao chiết. Y1 và Y2 càng lớn chứng tỏ hiệu suất quá trình chiết xuất là tốt. Thực hiện 27 thí nghiệm theo ma trận kế hoạch dưới đây:
Bảng 3.2.1. Bảng ma trận kế hoạch thực nghiệm
TT Biến mã hóa Hàm mục tiêu
A B C D Y1 (mg/g) Y2 (mg/g) 1 -1 -1 0 0 2 +1 -1 0 0 3 -1 +1 0 0 4 +1 +1 0 0 5 0 0 -1 -1 6 0 0 +1 -1 7 0 0 -1 +1 8 0 0 +1 +1 9 -1 0 0 -1 10 +1 0 0 -1 11 -1 0 0 +1 12 +1 0 0 +1 13 0 -1 -1 0 14 0 +1 -1 0 15 0 -1 +1 0 16 0 +1 +1 0 17 -1 0 -1 0 18 +1 0 -1 0 19 -1 0 +1 0 20 +1 0 +1 0
21 0 -1 0 -1 22 0 +1 0 -1 23 0 -1 0 +1 24 0 +1 0 +1 25 0 0 0 0 26 0 0 0 0 27 0 0 0 0
Trong đó, các giá trị biến thực và biến mã hóa tương ứng được thể hiện theo bảng sau:
Bảng 3.2.2. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ
Biến thực Biến mã Khoảng biến thiên (Δ) Mức nghiên cứu -1 0 1 Z1: Nhiệt độ chiết (0C) A
Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)
B
Z3: Thời gian chiết (phút) C
Z4: Công suất siêu âm (W) D
Các kết quả Y1, Y2 và các giá trị biến thực, biến mã hóa sẽ được tính tốn và thể hiện ở phần kết quả nghiên cứu. Tối ưu hóa các thơng số cơng nghệ của quy trình chiết xuất được thực hiện trên phần mềm Design Expert 7.0.0.
Phương trình hồi quy mơ tả mơ tả ảnh hưởng của các biến độc lập đối với hàm mục tiêu có dạng hàm đa thức bậc 2 (Hàm mục tiêu Y là chênh lệch khối lượng dầu béo trước và sau phản ứng). Phương trình tổng quát như sau:
Yk = b0 + + + (*)
Trong đó:
Yk: Biến phụ thuộc (k = 1 - 4)
Xi,j : Nhân tố mã hóa của biến độc lập ảnh hưởng đến Yk b0: Hệ số hồi quy thành phần tự do
buj: Hệ số hồi quy(hiệu ứng) tương tác đôi mô tả ảnh hưởng kép của biến Xi và Xj đến Yk
bjj: Hệ số hồi quy (hiệu ứng) bình phương mơ tả ảnh hưởng của biến Xj2 đến Yk