canthaxanthin
2.4.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp bổ sung chế phẩm canthaxanthin
Chế phẩm giàu canthaxanthin được tiến hành bổ sung vào thức ăn cho cá hồi bằng các phương pháp sau:
- Phương pháp phối trộn vào nguyên liệu trước khi ép đùn: Cân một lượng chính xác chế phẩm chứa canthaxanthin được làm giàu từ đề tài bổ sung vào hỗn hợp nguyên liệu trong qúa trình phối trộn các nguyên liệu của nhà máy. Hỗn hợp nguyên liệu chứa chế phẩm canthaxanthin này sẽ trải qua các bước sản suất của nhà máy: Trộn, nghiền, cấp hơi nấu chín, ép đùn, sấy khơ và áo dầu. Nhiệt độ trong buồng trộn: 80950C và trong thời gian 3 phút, tiếp sau đó hỗn hợp nguyên liệu sẽ được di chuyển sang vị trí đầu ép viên với nhiệt độ lên tới 120÷1350C, 2040 bar và trong thời gian 30 giây.
- Phương pháp trộn chế phẩm canthaxanthin vào viên thức ăn (phủ ngồi viên thức ăn): Cân một lượng chính xác chế phẩm canthaxanthin được làm giàu, hòa tan trong dầu ở nhiệt độ 65÷700C. Sử dụng hỗn hợp chất lỏng này phun lên thức ăn (áo dầu thức ăn). Thức ăn sau khi được áo dầu sẽ được làm khơ và đóng bao.
- Phương pháp trộn liposome có chứa canthaxanthin vào thức ăn: trộn thức ăn khơng chứa cantaxanthin và liposome có chứa các hàm lượng canthaxanthin khác nhau.
Thức ăn thành phẩm của các phương pháp bổ sung sẽ được thu mẫu và phân tích tại phịng thí nghiệm dinh dưỡng thủy sản thuộc trung tâm Công nghệ Sinh học nhằm xác định hàm lượng canthaxanthin chứa trong thức ăn sau q trình gia cơng.
2.4.2. Phương pháp xác định liều lượng bổ sung canthaxanthin vào thức ăn cá hồi
Tiến hành bổ sung chế phẩm canthaxanthin vào thức ăn cho cá Hồi vân với các liều lượng khác nhau và trộn thức ăn với liposome có chứa canthaxanthin với tỷ lệ khác nhau và tiến hành cho cá ăn với cách bố trí thí nghiệm như sau:
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 công thức
và mỗi công thức được lặp lại 3 lần. 270 con cá hồi có khối lượng trung bình 150g/con được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên vào 9 bể ximăng 4m3 với hệ thống nước chảy tràn liên tục.
Chăm sóc quản lý cá: Cá được cho ăn ngày 2 lần sáng và chiều, định kỳ tắm
hàng ngày vào lúc 6h và 14h. NO2, NH3, H2S và NO2 được test vào lúc 6h hàng ngày. Định kỳ 1 tháng cân mẫu 1 lần để kiểm tra tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống.
Các chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ sống, khối lượng cá tăng lên, tốc độ tăng trưởng
bình quân ngày, hệ số chuyển đổi thức ăn, màu sắc, hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng chất dinh dưỡng trong cơ thịt cá.
Đánh giá hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng trưởng của cá nuôi:
Tỷ lệ tăng trưởng tuyệt đối (SGR) (% khối lượng thân/ngày)=[(ln Wf (g) - ln Wi (g))/thời gian ni (ngày)]×100
Hệ số thức ăn (FCR): Tổng lượng thức ăn (kg)/Tổng khối lượng cá tăng thêm (kg)
cá:
Tỷ lệ sống (S) (%)=(Tổng số cá thu/Tổng số cá)×100
Phương pháp đánh giá màu sắc cơ thịt và hàm lượng canthaxanthin trong cơ thịt
- Số lượng mẫu thu: 10 mẫu /1 lơ thí nghiệm. Vị trí lấy mẫu so màu: cơ thịt cá vị trí giữa thân. Thời gian thu mẫu định kỳ: 30 ngày/lần.
- Phương pháp so màu: sử dụng thước đo màu SalmoFan Lineal để cho điểm theo thang điểm từ 20 đến 34 và điểm trung bình của 3 người quan sát khác nhau sẽ là điểm sử dụng để đánh giá [103].
Xác định nồng độ canthaxanthin trong cơ thịt: mẫu cơ thịt cá được thu tại cùng
một vị trí trên cơ lưng, 10 mẫu/lơ thí nghiệm sẽ được tách chiết bằng dung mơi hữu cơ, làm sạch và phân tích bằng máy sắc khí lỏng cao áp HPLC.
2.5. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa q trình cơng nghệ
Sau khi lựa chọn được các yếu tố cơng nghệ chính cần nghiên cứu và khảo sát ảnh hưởng đơn yếu tố của chúng tới quá trình. Tiếp theo sẽ tiến hành thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm theo mơ hình kế hoạch trực giao bậc hai của Box-Willson, kế hoạch chu bản bậc hai Box-Hunter hoặc kế hoạch Box-Behnken [82; 83]. Tùy vào yêu cầu của từng bài toán cụ thể và sự hiểu biết sơ bộ về ảnh hưởng của các biến mà lựa chọn mơ hình khảo sát để nghiên cứu và tối ưu hóa q trình cơng nghệ. Số thí nghiệm của ma trận kế hoạch được tính theo cơng thức sau:
- Đối với mơ hình bậc 2 của Box-Willson:
N = 2k + 2k + n0 với k < 5 và k=5 N = 2k-1 + 2k + n0 với k > 5
(N: số thí nghiệm; k: số yếu tố cơng nghệ; n0: số thí nghiệm tại tâm) Các mức của kế hoạch thực nghiệm sau khi được mã hóa bao gồm (-α; -1; 0; +1; +α). Trong đó α gọi là cánh tay địn và được tính theo cơng thức:
α 4 + 2k α2 – 2k-1(k + 0.5 n0) = 0 với k < 5 α 4 + 2k-1 α2 – 2k-2(k + 0.5 n0) = 0 với k > 5
Sau khi tính tốn được giá trị cánh tay địn α, ta sẽ thiết lập được ma trận kế hoạch thực nghiệm. Dựa vào đây ta có các thí nghiệm để tính tốn giá trị các hàm mục tiêu Y.
- Đối với mơ hình bậc 2 của Box – Hunter
N = 2k + 2k + n0 với k < 5 và k=5 N = 2k-1 + 2k + n0 với k > 5
(N: số thí nghiệm; k: số yếu tố cơng nghệ; n0: số thí nghiệm tại tâm) Các mức của kế hoạch thực nghiệm sau khi được mã hóa bao gồm (-α; -1; 0; +1; +α). Trong đó α gọi là cánh tay địn và được tính theo cơng thức:
α = 2k/4 (khi nhân kế hoạch 2k) α = 2(k-1)/4 (khi nhân kế hoạch 2k-1)
Số điểm ở tâm kế hoạch n0 được tăng lên để ma trận không suy biến, các giá trị α và n0 với số biến k khác nhau được cho ở bảng sau:
Bảng 2.5.1. Các thông số kế hoạchCác thông số Các thông số của kế hoạch K 2 3 4 5* 5 6* 6 Nhân kế hoạch 22 23 24 25-1 25 26-1 26 α 1.414 1.628 2 2 2.378 2.378 2.828 n0 5 6 7 6 10 9 15
- Đối với mơ bình bậc 2 của Box – Behnken: N = 22. + n0
(N: số thí nghiệm; k: số yếu tố cơng nghệ; n0: số thí nghiệm tại tâm) Các mức của kế hoạch thực nghiệm sau khi được mã hóa gồm (-1; 0; +1). Sau khi các giá trị hàm mục tiêu có được bằng thực nghiệm đầy đủ cho ma trận kế hoạch thực nghiệm, các bước thực hiện tiếp theo bao gồm:
Kiểm định sự có nghĩa của các hệ số hồi quy Kiểm định sự tương thích của mơ hình đã chọn Tối ưu hóa đồng thời nhiều hàm mục tiêu
Phương pháp tối ưu hóa hàm đa mục tiêu (phương pháp hàm nguyện vọng theo Harrington):
- Tối ưu hóa hàm mục tiêu đã chọn bằng phương pháp hàm nguyện vọng, phương pháp này gồm ba bước thực hiện
+ Thiết lập hàm mục tiêu: Yi = fi(X1, X2,..., Xk) có dạng tổng quát
Yk = b0 + + +
+ Chuyển đổi hàm mục tiêu thành hàm vi phân: di = Ti(Yi) + Thiết lập hàm mong đợi: D = g(d1, d2,...,dm)
- Harrington đã đưa ra phương thức tối ưu hóa đa mục tiêu bằng việc xây dựng hàm nguyện vọng, sau đó Derringer và Suich đã cải tiến việc tính tốn hàm nguyện vọng và được sử dụng trong phần mền Design Expert. Hàm nguyện vọng D được tính như sau:
D =
- Trong trường hợp các hàm mục tiêu di có tầm quan trọng hay thứ bậc khác nhau, thì hàm D được tính như sau, có tính đến thứ bậc quan trọng (wi) của các mục tiêu:
D = W =
- Các hàm di được tính như sau:
di = exp [- exp (Yi)] Khoảng chấp nhận một phía (phía trái hoặc phải) di = exp (- Yi) Khoảng chấp nhận 2 phía
2.6. Phân tích thống kê
Dữ liệu thử nghiệm được tính tốn với sai số trung bình và tiêu chuẩn. Dữ liệu trung bình của các cơng thức được xử lý trên phần mềm Minitab 16. So sánh Duncan được sử dụng để phân biệt từng thí nghiệm. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa khi giá trị p <0.05.
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM3.1. Lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn 3.1. Lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn
Mơi trường giữ giống thạch và hoạt hóa giống Marine Agar 2216 như đã trình bày.
Mơi trường nhân giống thạch YTN: (NH4)2SO4: 1.00g/l; Sucrose: 17.50g/l; Bột nấm men: 30.00g/l; NaCl: 17.50 g/l; Mono sodium glutamate: 6.47g/l; FeSO4: 1.00g/l; MgSO4: 1,00 g/l; Sodium malate (C4H4Na2O5): 1.89 g/l; KH2PO4: 4,50g/l; CoCl2: 2mg/l; Biotin: 0.10g/l; pH = 7; Agar: 25g/l.
Môi trường nhân giống lỏng các cấp và lên men YTN: (NH4)2SO4: 1.00g/l; Sucrose: 17.50g/l; Bột nấm men: 30.00g/l; NaCl: 17.50g/l; Mono sodium glutamate: 6.47g/l; FeSO4: 1.00g/l; MgSO4: 1.00g/l; Sodium malate (C4H4Na2O5): 1.89g/l; KH2PO4: 4.50g/l; CoCl2: 2.00mg/l; Biotin: 0.10 g/l; pH = 7; Dầu phá bọt antifoarm 204: 0.01% (Nhân giống trên thiết bị lên men 50 lít và lên men trên thiết bị 500 lít).
3.1.1. Lựa chọn thành phần môi trường
Nguồn cơ chất carbon được lựa chọn dựa trên nghiên cứu của Cyplik [104]. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường cơ bản NB 01 thay thế glucose bằng cơ chất carbon thí nghiệm ở cùng nồng độ. Thơng số đánh giá thí nghiệm là hàm lượng canthaxanthin (mg/g); Hàm lượng sinh khối (g/l) và hiệu suất tạo Canthaxanthin (mgCx/l).
Nguồn cơ chất Nitơ được lựa chọn dựa trên nghiên cứu của Cyplik [104]. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường cơ bản NB 01 thay thế pepton + cao nấm men bằng cơ chất nitơ thí nghiệm ở cùng nồng độ. Thơng số đánh giá thí nghiệm là hàm lượng canthaxanthin (mg/g); Hàm lượng sinh khối (g/l) và hiệu suất tạo Canthaxanthin (mgCx/l).
Hợp chất trung gian trong chu trình TCA (Hợp chất trung gian) được lựa chọn, đánh giá dựa trên kết quả nghiên cứu của Cyplik [104]. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường NB 01 bổ sung hợp chất trung gian.
Chất khống và chất vơ cơ được lựa chọn, đánh giá dựa trên kết quả và quy trình thực hiện của Hirasawa; Cyplik và Nasri [104]. Thí nghiệm được tiến hành trên mơi trường NB 01 bổ sung chất khống/chất vơ cơ được đánh giá.
Vitamin và acid amin được lựa chọn, đánh giá dựa trên kết quả và quy trình thực hiện của Calegari-Santos và Cyplik [104]; [105]. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường NB 01 bổ sung vitamin/acid amin được đánh giá.
Nồng độ cơ chất thí nghiệm được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.1.1. Thành phần môi trường và nồng độ sử dụng thí nghiệm
Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng Carbon Glucose 1 (g/l) Acid amin Glutamate 5mM Sucrose 1 (g/l) Aspartate 5 mM Starch 1 (g/l) Glutamine 5 mM Glycerol 1 (g/l) Asparagine 5 mM Lactose 1 (g/l) Alanine 5 mM Maltose 1 (g/l) Glycine 5 mM Fructose 1 (g/l) Threonine 5 mM Mannose 1 (g/l) Arginine 5 mM Maltodextrin 1 (g/l) Tyrosine 5 mM Nitơ NH4SO4 18 (g/l) Proline 5 mM Urea 18 (g/l) Phenylalanine 5 mM KNO3 18 (g/l) Leucine 5 mM Soy pepton 18 (g/l) Hợp chất trung gian chu trình TCA Acetate 5 mM Polypepton 18 (g/l) Citrate 5 mM Trypton 18 (g/l) Fumarate 5 mM
Yeast extract 18 (g/l) Alpha ketoglutarate 5 mM
Dried extract 18 (g/l) Malate 5 mM
Casein pepton 18 (g/l) Oxaloacetaet 5 mM
Meat extract 18 (g/l) Succinate 5 mM
Khoáng chất Mg 20 (mg/l) Vitamin Ascorbic acid 1 mM Fe 20 (mg/l) Riboflavin 1 mM Ca 20 (mg/l) Nicotinic acid 1 mM Mn 20 (mg/l) Pantothenic acid 1 mM Co 20 (mg/l) Pyridoxine 1 mM Zn 20 (mg/l) Thiamine 1 mM Mo 20 (mg/l) Cyanocobalamin 1 mM Ni 20 (mg/l) Pp 1 mM Se 20 (mg/l) Biotin 1 mM Bo 20 (mg/l) K 20 (mg/l)
3.1.2. Khảo sát tìm tâm thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợpcanthaxanthin canthaxanthin
Mục đích: Khảo sát, tìm tâm thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin dựa trên kết quả nghiên cứu của Kelly; Hirasawa; Tanaka; Tsuboka và Calegari Santos [105; 106]. Các yếu tố được khảo sát và mức khảo sát được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.1.2. Các yếu tố được khảo sát và mức khảo sát
Mức TN pH Nhiệt độ (0C) Tỷ lệ giống (%) Tốc độ khuấy (rpm) Thời gian (h) Ghi chú
M1 6 15 5 100 24 Môi trường giữ giống:
Marine Broth/Agar 2206 Môi trường nhân giống: BTN
Môi trường lên men: YTN
M2 6.5 20 7.5 150 36 M3 7 25 10 200 48 M4 7.5 30 12.5 250 60 M5 8 35 15 300 72 M6 8.5 40 350 96 M7 9 400 105 M8 500 120
3.1.3. Sàng lọc điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
Mục đích của thí nghiệm sàng lọc nhằm xác định mức ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181. Thí nghiệm được thiết kế theo ma trận Factorial minium Run Resolution IV screening, mức thấp (-1) và cao (+1) của các yếu tố được liệt kê trong các bảng sau.
Bảng 3.1.3. Ma trận Factorial minium Run Resolution IV screening
Yếu tố Đơn vị Mức thấp
(-1)
Mức cao (+1)
Ghi chú
pH 6 8 Mức tín hiệu sai khác signal =20;
Độ nhiễu Noise =5 Tỷ lệ tín hiệu/độ nhiễu (signal/noise ratio)=4
α =0.05: mức đánh giá sự có nghĩa của mơ hình/hàm đáp ứng.
Nhiệt độ 0C 20 30
Tốc độ khuấy rpm 100 500
Tỷ lệ giống % 2.5 15
Thời gian h 48 72
Yếu tố được chọn là yếu tố có p-value < 0.05, có mức độ ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến hàm đáp ứng Cx và Yield của mơ hình phân tích.
3.1.4. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
Từ kết quả sàng lọc bằng ma trận, các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181 được xác định giá trị tối ưu và đánh giá ở 5 mức (-α; -1; 0; +1; +α) trong CCD. Số liệu được phân tích bằng chương trình Design Expert 7.0.0 của Cơng ty Stat-Ease, Inc.USA. Đối với số yếu tố công nghệ là 5 (k=5), ta xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm như bảng sau:
Bảng 3.1.4. Bố trí ma trận kế hoạch thực nghiệmSTT A B C D E Y1 (mg/g) Y2 (mg Cx/l) STT A B C D E Y1 (mg/g) Y2 (mg Cx/l) 1 -1 -1 -1 -1 +1 2 +1 -1 -1 -1 -1 3 -1 +1 -1 -1 -1 4 +1 +1 -1 -1 +1 5 -1 -1 +1 -1 -1 6 +1 -1 +1 -1 +1 7 -1 +1 +1 -1 +1 8 +1 +1 +1 -1 -1 9 -1 -1 -1 +1 -1 10 +1 -1 -1 +1 +1 11 -1 +1 -1 +1 +1 12 +1 +1 -1 +1 -1 13 -1 -1 +1 +1 +1 14 +1 -1 +1 +1 -1 15 -1 +1 +1 +1 -1 16 +1 +1 +1 +1 +1 17 - α 0 0 0 0 18 + α 0 0 0 0 19 0 -α 0 0 0 20 0 + α 0 0 0 21 0 0 -α 0 0 22 0 0 + α 0 0 23 0 0 0 -α 0 24 0 0 0 + α 0 25 0 0 0 0 -α 26 0 0 0 0 + α 27 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 29 0 0 0 0 0 30 0 0 0 0 0 31 0 0 0 0 0 32 0 0 0 0 0
Trong đó Y1 (Cx) là hàm lượng canthaxanthin (mg/g) và Y2 là hiệu suất tạo Canthaxanthin (mgCx/l).
Từ kết quả phân tích xác định mức tối ưu của các yếu tố cho sản lượng canthanxanthin cực đại. Giá trị hàm đáp ứng theo thực nghiệm và tiên đốn theo mơ hình được đánh giá qua phân tích phương sai ANOVA. Phương trình hồi quy được dùng như mơ hình tiên đốn hàm lượng canthaxanthin, hàm lượng sinh khối và sản lượng hoạt chất thu được.
3.1.5. Lựa chọn mơ hình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
- Lựa chọn mơ hình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin phù hợp, đáp ứng yêu cầu về kinh tế, khả năng ứng dụng ở quy mô công nghiệp, sản lượng canthaxanthin cao.
Tiến hành: Các mơ hình lên men được thiết lập theo kết quả nghiên cứu của Zhang và Bae [106; 107].
Lên men theo mẻ: lên men trên môi trường YTN, thời gian lên men 72h.
Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất: lên men 24 h sau đó bổ sung cơ chất tại các thời điểm: 24h (+5g/l sucrose); 36h (+5g/l sucrose), 48h (+5g sucrose, 5g bột nấm men), 60h (+5g sucrose, 5g bột nấm men) và 72h (+5g sucrose, 5g bột nấm men). Quá trình lên men kết thúc sau 92h.
Lên men liên tục: lên men 24 h sau đó bổ sung cơ chất với nồng độ (0.52g sucrose + 0.32g bột nấm men/h trong 48h. Quá trình lên men kết thúc sau 92h.
Các thông số đánh giá quá trình lên men gồm: Hàm lượng canthaxanthin (mg/g), hàm lượng sinh khối (g/l), năng suất sinh tổng hợp canthaxanthin (mgCx/l), năng suất sinh tổng hợp canthaxanthin (mgCx/l.h).
Thí nghiệm lựa chọn điều kiện tối ưu sinh tổng hợp canthaxanthin trên mơ hình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất được thực hiện như sau:
Bảng 3.1.5. Lựa chọn điều kiện tối ưu sinh tổng hợp canthaxanthin
Thí nghiệm Số lần bổ sung Hàm lượng cơ chất bổ sung (g/lần) Thời gian bổ sung (h) Ghi chú Bổ sung sucrose 3 3g/lần; 4g/lần;