Điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin

TT

Biến mã hóa Giá trị biến mã

hóa Biến thực Giá trị Biến thực 1 A -0.06 pH 7.2 2 B 0.2 Nhiệt độ 26 3 C 0.11 Thời gian 61.32 4 D 0.19 Tỷ lệ giống 7.97 5 E -0.1 Tốc độ lắc 290

6 Hàm lượng Canthaxanthin

mg/g

8.81

7 Hiệu suất tạo

canthaxanthin

mgCx/l

116.36

Hình 4.1.9. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của hàm mục tiêu Y1 và Y2

Hình 4.1.10. Điều kiện tối ưu quá trình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin theo mơ hình xây dựng được

Tiến hành nghiên cứu thử nghiệm lại q trình sinh tổng hợp canthaxanthin ở quy mơ 3 lít với các điều kiện tối ưu được dự đốn theo mơ hình ở trên. Kết quả thực nghiệm thu được hàm lượng canthanxanthin: 8.76 ± 0.17 (mg/g) và hiệu suất tạo

canthaxanthin đạt 115.88 ± 1.12 (mgCx/l). Sự khác biệt giữa kết quả thực nghiệm và kết quả mơ hình dự đốn là khơng đáng kể. Do đó, có thể khẳng định mơ hình tính tốn tối ưu là tương hợp với thực nghiệm và có độ chính xác cao.

4.1.3. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men

- Mục đích: lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối vi sinh vật sau lên men. - Qua quá trình khảo sát các phương pháp thu nhận sinh khối sau sinh tổng hợp bằng các thiết bị sẵn có, chúng tơi đưa ra các thơng số thu hồi sinh khối được thể hiện ở bảng 4.1.8.

Bảng 4.1.8. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men

Thí nghiệm Điều kiện thí nghiệm Thơng số đánh giá

Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối

- Lắng, ly tâm: lắng sinh khối ở 40C/24h, ly tâm 10000 rpm, thiết bị ly tâm CEPA, Đức. - Lọc màng: khe lọc 0,6nm, tốc độ dịch: 180200l/h - Ly tâm bán liên tục, tốc độ ly tâm: 15000 rpm, tốc độ dịch: 600l/h

Hiệu suất thu nhận sinh khối

Lựa chọn tốc độ ly tâm

400; 500; 600; 700 vòng/phút Hiệu suất thu nhận sinh

khối Tỷ lệ sinh khối/nước

rửa sinh khối (m/V)

1 /2; 1 /3; 1 /4; 1 /5; 1 /6 Hiệu suất thu nhận sinh

khối, Bx dịch rửa

Số lần rửa 1 lần, 2 lần, 3 lần Hiệu suất thu nhận sinh

khối, Bx dịch rửa Tỷ lệ nước bổ sung

vào sinh khối trước sấy phun

1/1; 1/2; 1/3 Hiệu suất thu hồi chế

phẩm, hàm lượng Cx, cảm quan chế phẩm

Chế độ sấy 1550C/800C /2l/h/20000rpm;

1650C/850C /2.5l/h/20000rpm; 1750C/900C /2.5l/h/20000rpm;

Hiệu suất thu hồi chế phẩm, hàm lượng Cx, cảm quan chế phẩm Sau khi làm thí nghiệm, thu được điều kiện tối ưu cho thu nhận sinh khối:

- Ly tâm bán liên tục:  Tốc độ: 700 vòng/phút  Số lần ly tâm: 02 lần

 Tỷ lệ sinh khối/dịch rửa: 1/5 - Chế độ sấy phun:

 Tỷ lệ sinh khối/nước: 1/2 (w/v)  Nhiệt độ đầu vào/ra: 1650/850C  Tốc độ đĩa quay: 20.000 vòng/phút  Tốc độ tiếp liệu: 2.5 lít/h

4.1.4. Quy trình cơng nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ vikhuẩn ưa mặn quy mơ 80-100 lít/mẻ khuẩn ưa mặn quy mơ 80-100 lít/mẻ

Dựa trên các kết quả nghiên cứu đã có chúng tơi xây dựng hồn thiện quy trình cơng nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ chủng Paracoccus

Chủng giống

Paracoccus carotinifaciens VTP 20181

Tiếpthêmbột NM 6g/l tại 36h;

Tiếp thêm sucrose 5g/l tại 24h; 36h; 48h

Dịch thải

Thu hồi sinh khối

(Li tâm 700 v/ph, cơng suất 600 lít/h) Lên men trên thiết bị 500 lít

(pH=7.280C, khuấy 150v/ph, cấp khí 1 l/ ph, 64 giờ)

Nhân giống cấp III

(TB 50 lít, pH=7.280C, sục khí 1l/ph, khuấy150 v/ph, 28÷30 h)

Bổ sung nước: sinh khối: H2O=1:5 (w/v)

Dịch thải

Bổ sung nước: sinh khối: H2O=1:2 (w/v)

Sinh khối khô giàu canthaxanthin

Nhân giống cấp I (pH=7.280C, lắc 200v/ph, 48 giờ) Làm sạch sinh khối (Khuấy 200 v/ph, 10 phút, li tâm 700 v/ph, rửa 2 lần) Nhân giống cấp II (pH=7.280C, lắc 200v/ph, 35÷38 giờ) Sấy phun

(Nhiệt độ đầu vào/ra: 1650C/850C; tốc độ tiếp liệu 2.5 lít/giờ, tốc độ đầu đầu quay 20000 v/ph)

Hình 4.1.11. Quy trình cơng nghệ sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ Paracoccus carotinifaciens VTP 20181 quy mơ 80-100 lít/mẻ

Thuyết minh quy trình cơng nghệ

1. Chủng giống: Paracoccus carotinifaciens VTP 20181

- Chủng vi khuẩn Paracoccus carotinifaciens VTP 20181 được phân lập từ đất cánh đồng muối khu vực Diêm Điền, Thái Bình. Chủng được ni trên mơi trường Marine Agar 2216.

- Điều kiện bảo quản: Bảo quản trong ống thạch nghiêng dưới lớp parafin vô trùng, bảo quản ở 40C. Định kỳ 6 tháng kiểm tra, hoạt hóa và bảo quản lại một lần. Bảo quản trong dung dịch glycerol 10% ở -800C. Định kỳ 12 tháng kiểm tra, hoạt hóa và bảo quản lại một lần.

2. Nhân giống các cấp

- Điều kiện nhân tăng sinh: lấy 1 vòng que cấy giống từ ống thạch nghiêng cấy

vào môi trường tăng sinh Marine broth 2216.5ml môi trường/ống nghiệm, nhiệt độ nuôi cấy ở 280C lắc 200 v/ph, 48 giờ. Sau khi tăng sinh, xác định mật độ giống bằng phương pháp đo quang, giá trị OD(600nm) = 2.53 (tương đương mật độ giống đạt khoảng (2.53)x108 CFU/ml).

- Nhân giống cấp I: Mơi trường nhân giống YTN, nhân giống trên bình tam giác

100 ml, thể tích dịch nhân giống 25 ml, tỷ lệ tiếp giống hoạt hóa 10%, ni ở 280C, lắc 200 vòng/phút, thời gian nhân giống 48 giờ. Kết thúc nhân giống cấp I, xác định mật độ giống bằng phương pháp đo quang, giá trị OD(600nm) = 2.53 (tương đương mật độ giống đạt khoảng (2.53)x108 CFU/ml)

- Nhân giống cấp II: Mơi trường nhân giống YTN, nhân giống trên bình tam

giác 1000 ml, thể tích dịch nhân giống 250 ml, tỷ lệ tiếp giống cấp I 10%, nuôi ở 280C, lắc 200 vịng/phút, thời gian nhân giống 38÷40 giờ. Kết thúc nhân giống cấp II, xác định mật độ giống bằng phương pháp đo quang, giá trị OD(600nm)= 2.53 (tương đương mật độ giống đạt khoảng (2.53) x 108 CFU/ml).

- Nhân giống cấp III: Môi trường nhân giống YTN, nhân giống trên thiết bị lên

men FM-50 Fermentation tank B.E.Marubishi, thể tích dịch nhân giống 10 lít. Dịch nhân giống được điều chỉnh pH trước khi bổ sung muối, dầu phá bọt (được hấp riêng) bổ sung sau khi dịch nhân giống đã thanh trùng. Tỷ lệ tiếp giống cấp II 10%, nuôi ở 280C, khuấy 150 vịng/phút, sục khí 1 lít khơng khí/lít mơi trường/phút, thời gian nhân giống 2830 giờ. Kết thúc nhân giống cấp III, xác định mật độ giống bằng phương

pháp đo quang, giá trị OD(600nm) = 2.53 (tương đương mật độ giống đạt khoảng (2.53)x108 CFU/ml).

3. Lên men

- Lên men trên thiết bị FM-500 Fermentation tank B.E.Marubishi, thể tích dịch lên men 100 lít

- Mơi trường lên men YTN, dịch lên men được điều chỉnh pH trước khi bổ sung muối, biotin (lọc qua màng lọc) và dầu phá bọt (được hấp riêng) bổ sung sau khi dịch lên men đã thanh trùng

- Điều kiện lên men: Tỷ lệ giống cấp III là 10%, khuấy 150 vịng/phút, sục khí 1

lít khơng khí/lít mơi trường/phút. Cố định pH = 7,2 trong suốt quá trình lên men bằng NaOH 20% và HCl 6N, thời gian 64 giờ. Dầu phá bọt, biotin được hấp riêng và tiếp vào thiết bị lên men sau khi đã thanh trùng dịch lên men

- Tiếp thêm mơi trường:

+ Tiếp thêm sucrose: Nồng độ 5 g/lít dịch lên men tại 24; 36; 48 giờ lên men + Tiếp thêm bột nấm men: Nồng độ 6 g/lít dịch lên men tại 36; 48 giờ lên men

4. Thu hồi sinh khối ướt

Kết thúc lên men, lắp đường ống dẫn dịch lên men kết nối trực tiếp với máy ly tâm CEPA Z61. Tiến hành ly tâm 100 lít dịch sau lên men với vận tốc 700 v/ph, cơng suất 10 lít/ph. Thu sinh khối trữ trong thùng đựng sản phẩm. Hàm lượng sinh khối ướt ≥ 3.1 kg/mẻ, hàm ẩm khoảng 80%, hàm lượng canthaxanthin trong sinh khối ướt ≥ 2 mg/g.

5. Làm sạch sinh khối

Sinh khối thu được bổ sung nước theo tỷ lệ: sinh khối:H2O =1:5 (w/v), khuấy 200 v/ph, 10 phút, li tâm 700 v/ph, rửa 2 lần. Thu sinh khối sạch. Tỷ lệ hao hụt khi rửa khoảng 10%.

6. Sấy phun

Bổ sung nước vào sinh khối ướt theo tỷ lệ: sinh khối ướt/nước = 1:2 (w/v), sấy phun nhiệt độ đầu vào/ra là 1650C/850C; tốc độ tiếp liệu là 2.5 lít/giờ, tốc độ đầu đầu quay 20000 vòng/phút. Hiệu suất thu hồi 95% (≥0,6 kg skk/mẻ lên men, độ ẩm 3÷5%).

7. Sinh khối khô vi khuẩn giàu canthaxanthin

Sinh khối khô giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP 20181 thu được sau sấy phun, đạt các chỉ tiêu an tồn về hóa lý, vi sinh. Khơng

phát hiện có Coliforms, E.coli, Salmonella, tổng số bào tử NM-NM, hàm lượng các kim loại nặng như chì, cadimi, thủy ngân, asen nằm trong giới hạn cho phép. Hàm lượng canthaxanthin ≥ 10 mg/g skk, sinh khối khơ được đóng trong túi thiếc, bảo quản ở nhiệt độ phòng.

4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suấtchiết xuất chiết xuất

Sau khi thu hồi được sinh khối khơ giàu canthaxanthin, tiến hành q trình chiết và làm sạch để thu hồi canthaxanthin, các thơng số ảnh hưởng đến q trình chiết được khảo sát và tối ưu hóa được bao gồm:

- Nhiệt độ chiết.

- Tỷ lệ: dung môi/nguyên liệu. - Thời gian chiết.

- Công suất siêu âm

4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết

Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới hai hàm mục tiêu là Hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng được thể hiện ở hình 4.2.1.

Hình 4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới quá trình chiết

Dựa vào kết quả ở hình 4.2.1 ta thấy nhiệt độ ảnh hưởng khá nhiều tới khả năng chiết xuất canthaxanthin cũng như hàm lượng carotenoid tổng. Ở nhiệt độ chiết xuất là 300C, hàm lượng carotenoid tổng thu được là 17.6(mg/g) và hàm lượng canthaxanthin thu được là 14.2(mg/g). Khi nhiệt độ chiết xuất tăng từ 30÷350C thì hiệu suất tăng nhanh và đạt cực đại ở 350C với hàm lượng carotenoid tổng thu được là 18.1(mg/g) và

hàm lượng canthaxanthin thu được là 14.9 (mg/g). Khi ta tiếp tục tăng nhiệt độ lên 400C và 500C thì hàm lượng carotenoid tổng và hàm lượng canthaxanthin đều có xu hướng giảm dần đạt giá trị thấp nhất lần lượt là 15.7 (mg/g) và 12.5 (mg/g) tại nhiệt độ chiết 500C. Có thể thấy rằng nhiệt độ chiết từ 400C trở lên có thể làm phân hủy hoặc oxy hóa các hợp chất carotenoid nên làm giảm hàm lượng của carotenoid trong q trình chiết. Do đó, để đảm bảo cho q trình chiết xuất canthaxanthin và carotenoid tổng đạt hiệu quả cao nhất chúng tôi lựa chọn nhiệt độ chiết xuất ở mức cơ bản là là 350C để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Mức thấp (-1) và mức cao (+1) lần lượt là 300C và 400C.

4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi/ngun liệu tới q trình chiết

Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới hai hàm mục tiêu là hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng được thể hiện ở hình 4.2.2.

Hình 4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi/ngun liệu tới q trình chiết

Từ kết quả chỉ ra ở hình 4.2.2 ta thấy rằng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cũng ảnh hưởng nhiều tới khả năng chiết xuất canthaxanthin và carotenoid tổng. Trong q trình thí nghiệm ta thấy ở tỷ lệ dung mơi/ngun liệu là thấp (5/1; v/w) thì hiệu quả quá trình chiết xuất cịn thấp, hàm lượng canthaxanthin đạt 10.2 (mg/g) và hàm lượng carotenoid tổng đạt 14.7 (mg/g). Khi tăng tỷ lệ chiết lên (7/1; v/w) và (9/1, v/w) thì hiệu suất thu hồi canthaxanthin và carotenoid tổng cũng tăng lên và đạt lớn nhất tại tỷ lệ (9/1; v/w). Tại tỷ lệ (9/1; v/w), hàm lượng camthaxanthin đạt 15.1 (mg/g) và hàm lượng carotenoid tổng đạt 18.2 (mg/g). Tiếp tục tăng tỷ lệ chiết lên (11/1; v/w) và (13/1; v/w) thì hàm lượng thu hồi canthaxanthin và carotenoid tổng gần như không

thay đổi. Điều này có thể giải thích là ở tỷ lệ dung mơi thấp, nồng độ cao chiết trong dung môi nhanh đạt đến trạng thái bão hịa hơn vì vậy cản trở q trình trích ly các hợp chất trong ngun liệu, do đó hiệu suất chiết sẽ thấp hơn ở các tỷ lệ cao hơn. Do đó, chúng tơi chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 9/1 làm mức cơ bản để tiến hành các thí nghiệm tổng hợp tiếp theo. Mức thấp (-1) và mức cao (+1) lần lượt là 7/1 và 11/1 (v/w).

4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết

Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ thời gian chiết tới hai hàm mục tiêu là hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng được thể hiện ở hình 4.2.3.

Hình 4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết

Dựa vào kết quả ở hình 4.2.3 ta thấy thời gian chiết xuất cũng ảnh hưởng nhiều tới khả năng chiết xuất canthaxanthin và carotenoid tổng. Khi tăng dần thời gian chiết từ 30 phút đến 90 phút thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng tăng tuyến tính lần lượt từ 6.415.0 (mg/g) và 9.318.2 (mg/g). Khi tăng tiếp thời gian chiết xuất lên 120 phút và tiếp đến là 150 phút thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng thay đổi khơng đáng kể. Điều này có thể giải thích là khi thời gian chiết cịn thấp, thời gian thẩm thấu và khuếch tán vật chất là ngắn nên chưa thể vận chuyển hết vật chất từ nguyên liệu ra mơi trường. Khi tăng thời gian đủ dài thì lượng vật chất sẽ được vận chuyển tối đa ra môi trường. Thời gian chiết quá dài cùng không làm tăng thêm hàm lượng vật chất được chiết ra. Do đó, để đảm bảo về hiệu quả chiết xuất cũng như tối ưu về mặt năng lượng và thời gian của q trình, chúng tơi lựa chọn thời gian chiết

xuất là 90 phút làm mức cơ bản cho thí nghiệm tiếp theo. Mức thấp (-1) và mức cao (+1) lần lượt là 60 phút và 120 phút.

4.2.4. Ảnh hưởng của cơng suất siêu âm tới q trình chiết

Kết quả ảnh hưởng của cơng suất siêu âm tới hai hàm mục tiêu là hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng được thể hiện ở hình 4.2.4.

Hình 4.2.4. Ảnh hưởng của cơng suất siêu âm tới quá trình chiết

Dựa vào kết quả ở hình 4.2.4 có thể thấy cơng suất siêu âm là một trong 4 yếu tố cơng nghệ ảnh hưởng chính tới q trình chiết xuất. Khi cơng suất siêu âm tăng từ 100÷140 (W) thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng tăng mạnh tương ứng lần lượt từ 12.3÷15.2 (mg /g) và 14.5÷18.3 (mg/g). Tiếp tục tăng cơng suất siêu âm lên 160 (W) thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng bắt đầu có xu hướng giảm nhẹ tương ứng cịn 15.1 (mg/g) và 18.1 (mg/g). Cơng suất tăng lên 180 (W) thì cả hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng giảm nhanh hơn xuống còn 14.8 (mg/g) và 17.7 (mg/g). Điều này chứng tỏ cơng suất vi sóng ảnh hưởng cả tích cực lẫn tiêu cực đến q trình chiết xuất. Cơ chế này được giải thích là sóng siêu âm đóng vai trị như tác nhân phá bỏ các lớp màng tế bào của vật liệu chiết thông qua việc tạo thành các bong bóng khí nhỏ và liên lục bị vỡ tạo ra lực cắt cực lớn, điều này giúp quá trình khuếch tán vật chất từ vật liệu ra dung môi dễ dàng hơn. Tuy nhiên khi công suất siêu âm vượt ngưỡng lên mức q cao thì q trình trích ly lại bị cản trở do số bong bóng khí hình thành q nhiều, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi bị giảm đi làm hiệu suất chiết giảm đi. Do đó, cần chọn mức cơng suất siêu âm phù hợp cho quá trình

này. Từ kết quả khảo sát, công suất siêu âm ở các mức cơ bản là 140 (W), mức thấp (- 1) và mức cao (+1) được chọn lần lượt là 120 (W) và 160 (W).

4.2.5. Kết quả quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa các thơng số cơng nghệq trình chiết xuất q trình chiết xuất

Dựa vào các kết quả khảo sát đơn biến các thơng số cơng nghệ của q trình chiết xuất sinh khối thu canthaxanthin và carotenoid tổng, chúng tôi lựa chọn mức thí nghiệm cơ bản (mức 0), mức cao (+1) và mức thấp (-1) của các biến công nghệ và xây dựng bảng mã hóa các yếu tố cơng nghệ như sau: