Kết quả cho thấy có mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của ADG trong khoảng nồng độ từ 4,43 μg/ml đến 221,48 μg/ml với hệ số tương quan R2 = 1 > 0,99. Do đó, khoảng tuyến tính phù hợp để định lượng ADG trong các mẫu thử.
Độ lặp lại và độ ổn định hệ thống
Chuẩn bị mẫu chuẩn dung dịch ADG nồng độ khoảng 60 μg/ml rồi tiến hành sắc ký, lặp lại thao tác 6 lần. Độ lặp lại được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic, với yêu cầu giá trị RSD không vượt quá 5,3% ứng với ngưỡng nồng độ từ 10-100 μg/ml. Độ ổn định hệ thống được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu pic, với yêu cầu giá trị RSD không vượt quá 2%. Kết quả thu được ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Độ lặp lại và độ ổn định hệ thống của phương pháp phân tích
Lần Diện tích pic (mAu.s)
Thời gian lưu (phút) 1 2529272 7,305 2 2526514 7,287 3 2531417 7,296 4 2543711 7,296 5 2535309 7,297 6 2537795 7,312 RSD 0,25% 0,12% Yêu cầu ≤ 5,3% ≤ 2%
Kết quả cho thấy, giá trị độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic và thời gian lưu của ADG đều nằm trong khoảng quy định, chứng tỏ phương pháp phân tích có độ lặp lại và độ ổn định hệ thống đạt yêu cầu. y = 47577x + 3559.6 R² = 1 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 0 50 100 150 200 250 Diệ n tí ch pi c (m Au.s) Nồng độ ADG (g/ml)
22
Kết quả đánh giá các tiêu chí trên cho thấy có thể sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng ADG trong quá trình nghiên cứu.
3.1.2. Đánh giá độ tan của andrographolid
Độ tan của ADG trong mẫu nguyên liệu cao xuyên tâm liên được đánh giá theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.1.1 và kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Độ tan của ADG trong mẫu nguyên liệu cao xuyên tâm liên
Môi trường Độ tan của ADG (μg/ml)
HCl pH 1,2 207,0 ± 3,0
Đệm phosphat pH 6,8 196,6 ± 9,1 Đệm phosphat pH 7,4 208,9 ± 2,2
Nước tinh khiết 224,6 ± 7,8
Kết quả cho thấy, độ tan của ADG trong các các môi trường nước tinh khiết, HCl pH 1,2, đệm phosphat pH 6,8 và 7,4 là tương tự nhau. Hiện tượng này phù hợp với đặc điểm cấu trúc của ADG vì trong cấu trúc của hợp chất này khơng chứa nhóm chức có tính acid hoặc base đủ mạnh để chuyển sang trạng thái ion hố trong dung mơi nước.
3.1.3. Đánh giá độ hồ tan của andrographolid
Thơng thường, điều kiện “sink” cần được đảm bảo để đánh giá độ hoà tan dược chất. Tuy nhiên, để thuận lợi cho việc đánh giá tương quan giữa nguyên liệu và giữa các mẫu bào chế khi sàng lọc tá dược hấp phụ, đề tài lựa chọn mơi trường hồ tan là 250 ml dung dịch HCl pH 1,2 (sẽ được trình bày cụ thể hơn ở mục 3.4). Dung dịch poloxamer 407 1% (2 ml) được thêm vào mơi trường thử hồ tan nguyên liệu, bằng với lượng chất ổn định trong các mẫu bào chế, giúp hỗ trợ phân tán ngun liệu vào mơi trường hồ tan và tạo điều kiện để loại trừ ảnh hưởng của chất ổn định khi so sánh khả năng giải phóng dược chất giữa mẫu nguyên liệu với các mẫu bào chế. Kết quả độ hoà tan của ADG trong cao xuyên tâm liên nguyên liệu được thể hiện ở bảng PL-4.1 và hình 3.3.
Hình 3.3. Độ hồ tan của ADG trong ngun liệu
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 0 30 60 90 120 Mức độ gi ải phóng D C ( % ) Thời gian (phút)
23
Nhận xét: Có thể thấy, độ hồ tan của ADG trong nguyên liệu tương đối thấp, sau 120 phút mới giải phóng được 22,17% ± 2,56%. Điều này phù hợp với kết quả trước đó [119], góp phần khẳng định tốc độ hồ tan chậm của ADG là một trong những yếu tố tác động bất lợi tới khả năng hấp thu và sinh khả dụng của hoạt chất này.
3.2. Xây dựng cơng thức và quy trình bào chế tiểu phân nano andrographolid
3.2.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về cơng thức
Trong q trình bào chế nano tinh thể, chất ổn định là một trong những thành phần quan trọng đối với sự hình thành và ổn định hỗn dịch nano [2]. Chất ổn định thường sử dụng là các chất diện hoạt, có khả năng hấp phụ lên bề mặt tiểu phân nano, hạn chế sự kết tập tiểu phân nhờ lực đẩy tĩnh điện (với chất diện hoạt ion hố) hoặc lực cản khơng gian (với chất diện hoạt khơng ion hố) [35, 53]. Sự có mặt của chất diện hoạt ở nồng độ thích hợp có ý nghĩa cải thiện độ tan và tốc độ hồ tan dược chất [38]. Một số nhóm chất diện hoạt như poloxamer (poloxamer 407, poloxamer 188), cremophor (cremophor RH40, cremophor EL) cũng đã được báo cáo là có khả năng ức chế bơm P-gp tại ruột [6, 40, 79]. Những đặc điểm này tương đối phù hợp để góp phần giải quyết những yếu tố cản trở hấp thu của ADG bao gồm độ tan, độ hoà tan thấp và hiện tượnng bơm ngược tại ruột non, từ đó nâng cao sinh khả dụng của ADG.
Từ những thông tin trên, đề tài đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số chất diện hoạt khơng ion hố: Poloxamer 407, Poloxamer 188, Cremophor RH 40 và Tween 80 với các nồng độ khác nhau (từ 0,5% đến 5%) tới đặc tính tiểu phân nano ADG tạo thành trên thiết bị Retsch MM 200, các thông số của giai đoạn phân tán và nghiền giống như thông số đã nêu trong mục 2.3.2.2. Khối lượng cao xuyên tâm liên được cố định là 5% (kl/tt) so với tổng thể tích hỗn dịch nghiền. Kết quả đánh giá KTTPTB, PDI và độ tăng kích thước sau 3 ngày (D3d) đối với các mẫu có KTTPTB dưới 1000 nm được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.4.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất diện hoạt tới một số đặc tính tiểu phân nano ADG
Công thức Loại chất diện hoạt Nồng độ KTTPTB (nm) PDI D3d CT1.1 Poloxamer 407 0,5% 271,3 ± 7,2 0,107 ± 0,024 1,186 CT1.2 Poloxamer 407 1% 250,9 ± 10,4 0,123 ± 0,016 1,135 CT1.3 Poloxamer 407 3% 297,5 ± 3,3 0,137 ± 0,047 0,986 CT1.4 Poloxamer 407 5% 324,7 ± 5,4 0,111 ± 0,030 1,002 CT2.1 Poloxamer 188 0,5% 1467 ± 328,1 0,314 ± 0,185 - CT2.2 Poloxamer 188 1% 776,7 ± 193,1 0,252 ± 0,079 1,560 CT2.3 Poloxamer 188 3% 252,9 ± 3,3 0,183 ± 0,009 3,331 CT2.4 Poloxamer 188 5% 312,9 ± 4,3 0,139 ± 0,042 2,642
24 CT3.1 Cremophor RH40 0,5% 1561,0 ± 90,6 0,177 ± 0,061 - CT3.2 Cremophor RH40 1% 1258,7 ± 185,4 0,207 ± 0,030 - CT3.3 Cremophor RH40 3% 402,3 ± 8,6 0,189 ± 0,015 1,029 CT3.4 Cremophor RH40 5% 313,6 ± 9,8 0,133 ± 0,022 1,025 CT4.1 Tween 80 0,5% 3164,0 ± 293,3 0,321 ± 0,078 - CT4.2 Tween 80 1% 566,3 ± 129,0 0,274 ± 0,030 1,523 CT4.3 Tween 80 3% 349,9 ± 17,1 0,217 ± 0,010 0,998 CT4.4 Tween 80 5% 306,3 ± 1,7 0,135 ± 0,038 0,975
Hình 3.4. Ảnh hưởng của chất diện hoạt tới KTTPTB tiểu phân nano ADG
Nhận xét:
+ Theo chiều tăng của nồng độ chất diện hoạt, kích thước tiểu phân có xu hướng giảm. Nồng độ chất diện hoạt tương ứng với mẫu có KTTPTB nhỏ nhất với mỗi chất diện hoạt lần lượt là: 1% đối với poloxamer 407; 3% đối với poloxamer 188 và 5% đối với cremophor RH 40 và tween 80.
+ Đối với 2 chất diện hoạt nhóm poloxamer, khi tiếp tục tăng nồng độ diện hoạt, KTTPTB của tiểu phân nano ADG thu được có xu hướng tăng lên.
+ PDI trong trường hợp poloxamer 188, cremophor RH40 và tween 80 đều có xu hướng giảm và ổn định hơn khi nồng độ tăng; đối với poloxamer 407, PDI dao động nhưng đều ở mức tương đối thấp, dưới 0,25.
+ Kết quả theo dõi độ ổn định cho thấy, các mẫu chứa poloxamer 407 (ở cả 4 nồng độ), cremophor RH 40 và tween 80 (ở nồng độ 3% và 5%) hầu như khơng tăng kích thước sau 3 ngày bảo quản. Trong khi đó, mẫu chứa poloxamer 188 có kích thước tăng lên nhiều (từ 1,5 đến 3,3 lần) sau quá trình bảo quản.
Các chất diện hoạt được khảo sát trong đề tài đều là chất diện hoạt khơng ion hố, vì vậy cơ chế chính cho sự hình thành và ổn định tiểu phân nano là lực cản không gian
0.0 500.0 1000.0 1500.0 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 0.50% 1% 3% 5% Loại ch ất diện h oạt Kích th ước ( nm ) Nồng độ chất diện hoạt (kl/tt)
Ảnh hưởng của chất diện hoạt tới KTTPTB
Poloxamer 407 Poloxamer 188 Cremophor RH40 Tween 80
25
[53], khi đó khối lượng phân tử, nồng độ và mức độ sơ nước của chất ổn định so với dược chất là những đặc tính lý hố cần chú ý [47]. Một số tính chất của các chất diện hoạt được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Một số đặc tính của các chất diện hoạt sử dụng trong đề tài [87]
Chất diện hoạt Poloxamer 407 Poloxamer 188 Cremophor RH40 Tween 80
KLPT 12600 8400 2600 1310
HLB 22 29 14,3 15
+ Về KLPT: khi KLPT tăng, kích thước phân tử chất diện hoạt tăng, cản trở sự tập hợp tiểu phân tốt hơn, giúp tiểu phân nano tạo thành dễ đạt và duy trì kích thước nhỏ [25, 47, 103]. Điều này phù hợp với thực nghiệm: poloxamer 407 là chất diện hoạt có KLPT lớn nhất, cho tiểu phân nano dưới 300 nm ngay ở nồng độ 0,5%; poloxamer 188 có KLPT trung bình, cho tiểu phân nano dưới 300 nm ở nồng độ 3%; cịn với hai chất diện hoạt có KLPT nhỏ, tới nồng độ 5% mới cho tiểu phân nano khoảng 300 nm.
+ Về nồng độ chất diện hoạt: khi nồng độ tăng dần tới một ngưỡng tối ưu, khả năng bao phủ bề mặt tiểu phân nano tăng, giúp tiểu phân nano dễ đạt và duy trì kích thước nhỏ[53]. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ chất ổn định cao vượt ngưỡng tối ưu, quá trình nghiền có thể bị cản trở do độ nhớt lớn của hệ, ngồi ra, độ nhớt lớn cịn tăng khả năng lưu giữ bọt khí trong dịch, tạo thành bề mặt lỏng-khí cạnh tranh hấp phụ chất ổn định [30, 64]. Poloxamer 407 và poloxamer 188 đều là các chất diện hoạt có khối lượng phân tử lớn và độ nhớt cơ bản tương đối cao, ngưỡng nồng độ tối ưu thấp hơn nồng độ giới hạn được khảo sát, do đó có thể quan sát được hiện tượng này.
+ Về mức độ sơ nước chất ổn định so với dược chất: ADG là dược chất tương đối sơ nước với log P = 2,632 ± 0,135 [73], vì vậy, chất ổn định thân nước mạnh khó được lưu giữ trên bề mặt tiểu phân, ảnh hưởng không tốt đến độ ổn định. Kết quả mẫu poloxamer 188 ở nồng độ 3% và 5% phản ánh rõ hiện tượng này, bởi đây chất diện hoạt thân nước mạnh với HLB = 29. Cremophor RH40, tween 80 và phần nào đó là poloxamer 407 có HLB thấp hơn, phù hợp để liên kết ổn định hơn với bề mặt tiểu phân nano, do đó duy trì được kích thước tiểu phân trong q trình bảo quản.
Kết luận: Đề tài lựa chọn chất ổn định là poloxamer 407 với nồng độ 1% (kl/tt)
tương ứng với lượng cao xuyên tâm liên là 5% (kl/tt) để tiếp tục nghiên cứu.
3.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về quy trình nghiền bi
3.2.2.1. Ảnh hưởng của tốc độ nghiền bi
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nghiền bi trên thiết bị Retsch MM 200 với hai giá trị 15 Hz và 30 Hz, các thông số khác giống với thông số đã nêu trong mục 2.3.2.2. Kết quả được trình bày tại bảng PL-2.5 và hình 3.5a.
Kết quả cho thấy, khi tăng tốc độ nghiền từ 15 Hz lên 30 Hz, KTTPTB và PDI của nano ADG đều giảm. Kết quả phù hợp với lí thuyết, bởi khi tốc độ nghiền tăng, cường độ
26
của lực va chạm tăng, do đó tiểu phân được nghiền nhỏ và đồng đều hơn. Vì vậy, đề tài lựa chọn tốc độ nghiền là 30 Hz để tiến hành các khảo sát tiếp theo.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của một số yếu tố quy trình tới KTTPTB và PDI của tiểu phân nano ADG: (a) ảnh hưởng của tốc độ nghiền, (b) ảnh hưởng của thời gian nghiền, (c)
ảnh hưởng của khối lượng bi
3.2.2.2. Ảnh hưởng của tổng thời gian nghiền bi.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian nghiền trên thiết bị Retsch MM 200 ở tốc độ 30 Hz với tổng thời gian từ 0,5-3 giờ, các thơng số cịn lại giống với thông số đã nêu trong mục 2.3.2.2. Kết quả được trình bày tại bảng PL-2.6 và hình 3.5b.
Kết quả cho thấy, khi tổng thời gian nghiền tăng từ 0,5 đến 2 giờ, KTTPTB và PDI đều có xu hướng giảm, do tăng cường sự tiếp xúc giữa tiểu phân ADG và lực va chạm trong quá trình nghiền. Tuy nhiên, khi tăng thời gian nghiền từ 2 giờ lên 3 giờ, kích thước tiểu phân có xu hướng giảm thêm nhưng khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê, trong khi đó PDI có xu hướng tăng nhẹ, có thể là do quá trình làm giảm KTTP đã đạt tới ngưỡng cân bằng. Do vậy, để quy trình bào chế đơn giản và thuận tiện, thu được các tiểu phân nano ADG đồng đều, đề tài đã lựa chọn thời gian nghiền là 2 giờ.
3.2.2.3. Ảnh hưởng của khối lượng bi
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của khối lượng bi zirconium oxyd ở mức 10 g và 20 g trên thiết bị Retsch MM200 ở tốc độ nghiền 30 Hz, tổng thời gian nghiền là 2 giờ, các thơng số cịn lại giống với thông số đã nêu trong mục 2.3.2.2. Kết quả được trình bày ở bảng PL-2.7 và hình 3.5c.
Khi tăng khối lượng bi từ 10 g lên 20 g, KTTPTB và PDI đều giảm. Kết quả này phù hợp với lý thuyết, bởi tăng khối lượng bi giúp tăng số số va chạm giữa bi với các tiểu phân trong quá trình nghiền, do đó, tiểu phân được làm nhỏ nhiều và đồng đều hơn. Vì vậy, đề tài đã lựa chọn khối lượng bi là 20 g để tiếp tục nghiên cứu.
Kết luận: Qua các khảo sát trên, đề tài lựa chọn thơng số của q trình nghiền bi
như sau: khối lượng bi zirconi oxyd (0,65 mm): 20 g; tốc độ nghiền: 30 Hz; thời gian 0.00 0 0.08 0 0.16 0 0.24 0 0.32 0 0.40 0 0.0 80.0 160.0 240.0 320.0 400.0 15 30 KT T P ( n m ) Tốc độ nghiền (Hz) (a) Ảnh hưởng của tốc độ nghiền 0.00 0 0.08 0 0.16 0 0.24 0 0.32 0 0.40 0 0.0 80.0 160 .0 240 .0 320 .0 400 .0 0.5 1 2 3
Thời gian nghiền (giờ)
(b) Ảnh hưởng của thời gian nghiền
KTTPTB PDI 0.000 0.080 0.160 0.240 0.320 0.400 0.0 80.0 160 .0 240 .0 320 .0 400 .0 10 20 P DI Khối lượng bi (g) (c) Ảnh hưởng của khối lượng bi
27
nghiền: 2 tiếng (trong đó, mỗi 15 phút nghiền thì nghỉ 5 phút để đảm bảo khả năng hoạt động ổn định của thiết bị).
3.2.3. Đánh giá tiểu phân nano andrographolid sau quá trình bào chế
3.2.3.1. Hàm lượng dược chất trong quá trình nghiền
Trong quá trình nghiền bi, hiện tượng va chạm và ma sát làm mẫu nóng lên, trong một số trường hợp có thể tác động bất lợi tới độ ổn định dược chất, làm giảm hàm lượng dược chất. Đề tài tiến hành đánh giá hàm lượng dược chất trong mẫu ở các giai đoạn của quy trình bào chế và đồng thời đánh giá KTTP (trên thiết bị Mastersizer 3000E với mẫu ban đầu và mẫu sau nghiền khí nén, trên thiết bị Zetasizer ZS90 với hỗn dịch nano), kết quả được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả theo dõi hàm lượng dược chất và KTTP trong q trình bào chế
Thơng số Cao ban đầu Cao sau nghiền
khí nén Hỗn dịch nano Hàm lượng dược chất (so
với tổng KL cao) (%) 32,61 ± 0,55 32,33 ± 0,61 32,21 ± 0,44
KTTP (μm) 123,7 ± 7,1 58,7 ± 1,5 0,2509 ± 0,0104
Kết quả cho thấy, có sự giảm đáng kể kích thước tiểu phân ADG sau mỗi bước, tuy nhiên hàm lượng ADG trong các mẫu khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Như vậy, có thể kết luận rằng, q trình nghiền khí nén và nghiền bi tác động khơng đáng kể tới độ ổn định của ADG và không làm giảm hàm lượng ADG.
3.2.3.2. Tỉ lệ dược chất dạng hoà tan và tỉ lệ dược chất vùng nano
Thông thường, với một quy trình bào chế tiểu phân nano đủ hiệu quả, tỉ lệ dược chất còn tồn tại ở dạng tiểu phân kích thước lớn trên 1000 μm rất ít, vì vậy tổng lượng