Thông số Cao ban đầu Cao sau nghiền
khí nén Hỗn dịch nano Hàm lượng dược chất (so
với tổng KL cao) (%) 32,61 ± 0,55 32,33 ± 0,61 32,21 ± 0,44
KTTP (μm) 123,7 ± 7,1 58,7 ± 1,5 0,2509 ± 0,0104
Kết quả cho thấy, có sự giảm đáng kể kích thước tiểu phân ADG sau mỗi bước, tuy nhiên hàm lượng ADG trong các mẫu khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Như vậy, có thể kết luận rằng, q trình nghiền khí nén và nghiền bi tác động khơng đáng kể tới độ ổn định của ADG và không làm giảm hàm lượng ADG.
3.2.3.2. Tỉ lệ dược chất dạng hoà tan và tỉ lệ dược chất vùng nano
Thơng thường, với một quy trình bào chế tiểu phân nano đủ hiệu quả, tỉ lệ dược chất cịn tồn tại ở dạng tiểu phân kích thước lớn trên 1000 μm rất ít, vì vậy tổng lượng dược chất ở dạng hoà tan và dược chất vùng nano có giá trị xấp xỉ bằng lượng dược chất tồn phần trong hệ. Để nhận biết sự có mặt của các tiểu phân kích thước lớn, đơi khi việc sử dụng thiết bị Zetasizer ZS90 là không hiệu quả do hiện tượng sa lắng tiểu phân trong thời gian để ổn định, vì vậy đề tài đã đánh giá lại phân bố KTTP nano ADG trên thiết bị Mastersizer 3000E.
Kết quả cho thấy, với mẫu hỗn dịch sau bào chế, có thể phát hiện tín hiệu tiểu phân ở vùng kích thước lớn trên 10 μm. Các tiểu phân ở vùng kích thước lớn này có thể là dược chất hoặc tạp chất có sẵn trong nguyên liệu ban đầu, vì vậy đề tài đã tiến hành ly tâm với tốc độ thấp (1000 vịng/phút) như đã trình bày ở phần e mục 2.3.2.3 để loại đi các tiểu phân đó. Qua khảo sát, thời gian ly tâm phù hợp là 10 phút (kết quả khơng được trình bày cụ thể ở đây). Kết quả đánh giá với mẫu sau ly tâm cho thấy tín hiệu tiểu phân vùng kích thước lớn đó gần như đã bị triệt tiêu, như vậy có thể sơ bộ kết luận rằng quá trình ly tâm kể trên là phù hợp để loại bỏ các tiểu phân lớn trong hệ (hình PL-3.3). Đề tài cũng xác định lượng dược chất tự do trong hệ sau khi siêu ly tâm ở các khoảng thời gian
28
khác nhau (30 phút, 60 phút, tương ứng với 𝑚𝑡𝑑−30 và 𝑚𝑡𝑑−60 để đánh giá cụ thể hơn ảnh hưởng của thời gian siêu ly tâm tới mức độ sa lắng tiểu phân. Các kết quả được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Các giá trị mtp, mt, mtd-30 và mtd-60 (tương đương 2 ml hỗn dịch)
Thơng số Giá trị (mg)
Lượng dược chất tồn phần (𝑚𝑡𝑝) 16,10 ± 0,22
Tổng lượng dược chất tự do và dược chất vùng nano (𝑚𝑡) 15,88 ± 0,77 Lượng dược chất tự do sau 30 phút siêu ly tâm (𝑚𝑡𝑑−30) 3,53 ± 0,14 Lượng dược chất tự do sau 60 phút siêu ly tâm (𝑚𝑡𝑑−60) 3,53 ± 0,31
Kết quả cho thấy, giá trị 𝑚𝑡 xấp xỉ bằng giá trị 𝑚𝑡𝑝 (khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê), như vậy có thể sơ bộ kết luận rằng q trình nghiền bi có hiệu quả đáng kể trong việc làm giảm kích thước tiểu phân ADG về vùng nano. Tuy nhiên, độ lệch chuẩn của 𝑚𝑡 cịn tương đối lớn, do đó cần đánh giá thêm. Lượng dược chất tự do sau khi siêu ly tâm trong 30 phút và 60 phút khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05), như vậy có thể sơ bộ kết luận rằng, khả năng sa lắng tiểu phân nhờ siêu ly tâm đã đạt cân bằng sau 30 phút. Từ các kết quả trên và công thức được trình bày tại phần e mục 2.3.3.3, tỉ lệ dược chất dạng hoà tan và tỉ lệ dược chất vùng nano lần lượt bằng 21,93% và 76,71%.
3.2.3.3. Quan sát tiểu phân andrographolid qua kính hiển vi điện tử quét
Tiến hành quan sát để đánh giá kích thước và hình thái tiểu phân ADG trong mẫu tối ưu trên kính hiển vi điện tử quét (SEM). Quy trình chuẩn bị mẫu theo phương pháp ghi ở phần b mục 2.3.2.3, kết quả được thể hiện ở hình 3.6.
29
KTTP trên ảnh được xác định với sự hỗ trợ của phần mềm Adobe Illustrator CC 2020 và Microsoft Excel 2019. Kết quả cho thấy, tiểu phân ADG có nhiều hình dạng, đa số có kích thước trong khoảng 170-290 nm. KTTPTB của tiểu phân là 233,4 ± 40,9 nm, tương đối phù hợp với kết quả thu được trên thiết bị Zetasizer ZS90.
3.2.3.4. Quan sát tiểu phân andrographolid qua kính hiển vi điện tử truyền qua
Tiến hành quan sát để đánh giá kích thước và hình thái tiểu phân nano ADG trong mẫu tối ưu trên kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Quy trình chuẩn bị mẫu theo phương pháp ghi ở phần c mục 2.3.2.3, kết quả được thể hiện trên hình 3.7.
Hình 3.7. Hình ảnh chụp TEM tiểu phân nano ADG
Kết quả cho thấy, tiểu phân có nhiều hình dạng, kích thước chủ yếu nằm trong khoảng 170-370 nm, KTTPTB đạt 272,5 ± 67,6 nm. Kết quả này khá tương đồng, có xu hướng lớn hơn một chút so với kích thước tiểu phân thu được từ thiết bị Zetasizer ZS90 và mẫu chụp SEM. Điều này có thể là do mẫu bào chế mất một khoảng thời gian chờ khá dài (khoảng 10 ngày) trước khi được chụp, dẫn tới KTTP tăng.
3.3. Tiếp tục xây dựng cơng thức và quy trình bào chế tiểu phân betaglucan
Betaglucan là vật liệu hữu cơ ổn định bởi các liên kết glycosid trong mạch betaglucan tương đối bền vững, mặt khác các mạch dài của betaglucan có xu hướng cuộn xoắn vào nhau thông qua các liên hết hydro liên mạch, tạo cấu trúc xoắn ba (triple-helix), điều này đã được chứng minh thông qua phổ nhiễu xạ tia X [61]. Cấu trúc không gian của betaglucan [61] được thể hiện ở hình 3.8.
Kích thước trung bình của betaglucan nguyên liệu đã được xác định thông qua thiết bị Mastersizer 3000E, cho kết quả KTTP là 33,27 ± 1,12 μm, khơng xuất hiện tín hiệu vùng dưới 2 μm, tỉ lệ tiểu phân dưới 10 μm khơng lớn (hình PL-3.2). Như đã trình bày ở trên, để quá trình bắt giữ bởi tế bào M có thể xảy ra, kích thước tiểu phân cần được giảm tới dưới 10 μm, và hấp thu tối ưu đạt được với ngun liệu có kích thước
30
dưới 2 μm [33]. Như vậy, quá trình hấp thu nguyên liệu thô betaglucan (33,27 ± 1,12 μm) trong đường tiêu hố là khơng hiệu quả. Điều này chứng minh tính cần thiết của việc giảm KTTP betaglucan với mục đích tăng cường hấp thu và từ đó cải thiện tác dụng trên hệ miễn dịch của betaglucan.
Hình 3.8. Cấu trúc khơng gian của betaglucan
3.3.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức
3.3.1.1. Ảnh hưởng của tác nhân tháo xoắn và tác nhân thuỷ phân liên kết glycosid
Đề tài đã tiến hành khảo sát sơ bộ quá trình nghiền bi nano betaglucan với nước tinh khiết và một số dung dịch chất ổn định (NaTPP, Poloxamer 407, PVP K30), tuy nhiên kết quả cho thấy hầu như khơng thu được tiểu phân nano (hình PL-3.1). Kết quả góp phần chứng minh tính ổn định của nguyên liệu betaglucan và do đó, chỉ sử dụng lực tác động cơ học trong q trình nghiền là khơng đủ hiệu quả để làm giảm kích thước tiểu phân. Vì vậy, đề tài đã sử dụng các tác nhân tháo xoắn mạch và tác nhân thuỷ phân một phần liên kết glycosid trong mạch để hỗ trợ quá trình nghiền.
Tác nhân tháo xoắn mạch có tác dụng tách mạch xoắn ba của betaglucan thành dạng mạch đơn, có thể là dung dịch kiềm (như NaOH với nồng độ 0,25M hay 1% (kl/tt) trở lên, một số tài liệu cho rằng pH từ 12 trở lên là phù hợp), DMSO hoặc khi tăng nhiệt độ lên trên 135°C [48, 62, 95]. Trong các tác nhân trên, kiềm là tác nhân dễ ứng dụng nhất. Tác nhân kiềm khiến nhóm hydroxyl trên mạch betaglucan ion hố một phần, tạo lực đẩy tĩnh điện giữa các mạch và khiến chúng tách nhau ra [62, 95].
Để thuỷ phân một phần liên kết glycosid trong betaglucan, tác thường được dùng là các acid, đặc biệt là acid vơ cơ [4, 48, 93, 96]. Có thể sử dụng chất oxy hoá mạnh như NaClO [96] nhưng sẽ gây phá huỷ cấu trúc, làm mất hoạt tính của betaglucan.
Cần lưu ý rằng, có phản ứng trung hồ xảy ra giữa acid và kiềm. Khi acid bị trung hoà, phản ứng thuỷ phân liên kết glycosid sẽ chậm lại do tốc độ phản ứng tỉ lệ với nồng độ của ion H+, phản ứng gần như ngừng lại ở vùng pH cao [4, 93]. Ngược lại, một số
31
nghiên cứu cho thấy quá trình tháo xoắn bởi kiềm là q trình biến tính thuận nghịch một phần, khi kiềm được loại bỏ bằng các biện pháp khác nhau (thẩm tích với nước, pha lỗng, trung hồ…), mạch betaglucan có thể tái xoắn trở lại theo nhiều cách khác nhau [62, 95]. Như vậy, sự có mặt của tác nhân tháo xoắn và tác nhân thuỷ phân, thứ tự đưa cũng như tỉ lệ giữa các tác nhân có thể ảnh hưởng tới hiệu quả của từng tác nhân và do đó ảnh hưởng đến tiểu phân betaglucan thu được.
Đề tài đã lựa chọn tác nhân tháo xoắn là dung dịch NaOH 2% (kl/tt) và tác nhân thuỷ phân là HCl 1% (kl/tt) để tiếp tục nghiên cứu. Cơ chế tác động của tác nhân thuỷ phân và tháo xoắn được mơ tả ở hình 3.9.
Hình 3.9. Cơ chế tác động của tác nhân thuỷ phân và tháo xoắn
Để đánh giá vai trò của các tác nhân, đề tài tiến hành một số quy trình nghiền như bảng 3.7 với lượng betaglucan là 20 mg và các thơng số của q trình nghiền bi giống với thông số đã nêu trong mục 2.3.2.1.
Bảng 3.7. Thiết kế thí nghiệm đánh giá vai trị của tác nhân tháo xoắn và thuỷ phân
Quy trình Thao tác Đánh giá
A Khuấy trong 1 giờ/60°C và nghiền bi với 6 ml nước tinh khiết
Khơng có tác nhân tháo xoắn và thuỷ phân B Khuấy trong 1 giờ/60°C và nghiền bi với 6 ml
HCl 1%
Khơng có tác nhân tháo xoắn
C Khuấy trong 1 giờ/60°C và nghiền bi với 6 ml NaOH 2%
Khơng có tác nhân thuỷ phân
D Khuấy với 2 ml NaOH 2% trong 1 giờ/60°C, sau đó nhỏ từ từ vào 4 ml HCl 1% và nghiền bi
Đưa tác nhân tháo xoắn trước tác nhân thuỷ phân E Khuấy với 4 ml HCl 1% trong 1 giờ/60°C, sau
đó nhỏ từ từ vào 2 ml NaOH 2% và nghiền bi
Đưa tác nhân thuỷ phân trước tác nhân tháo xoắn Kết quả về tỉ lệ khối lượng tiểu phân ở các vùng kích thước, KTTPTB, PDI và pH của các mẫu được trình bày trong bảng 3.8.
a) Sơ bộ kết luận ảnh hưởng của pH mơi trường nghiền tới q trình nghiền
Các mẫu A, B, C tương ứng với các vùng pH khác nhau của dịch nghiền, mẫu A ứng với pH trung tính, mẫu B ứng với pH acid của tác nhân thuỷ phân và mẫu C ứng với pH kiềm của tác nhân tháo xoắn.
32
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tác nhân thuỷ phân và tháo xoắn tới hiệu quả nghiền
Thông số Mẫu NL A B C D E Tỉ lệ tiểu phân (%) < 1 μm 0 0 0 35,68 ± 16,36 39,17 ± 14,3 69,87 ± 4,41 1-10 μm 15,8 ± 0,35 13,37 ± 4,14 1,23 ± 0,01 26,12 ± 10,31 31,61 ± 1,09 8,67 ± 0,18 > 10 μm 84,2 ± 0,36 86,63 ± 4,14 98,77 ± 0,01 38,2 ± 6,11 29,22 ± 13,26 21,46 ± 4,16 KTTPTB (nm) - 1704,5 ± 567,8 2073,5 ± 166,2 1265,7 ± 134,6 910,6 ± 47,0 416,4 ± 8,9 PDI - 1,000 1,000 0,422 ± 0,280 0,294 ± 0,111 0,246 ± 0,043 pH - 6,67 ± 0,06 0,92 ± 0,07 12,97 ± 0,21 11,92 ± 0,03 12,08 ± 0,15 Kết quả cho thấy, mẫu C có KTTPTB và PDI nhỏ hơn so với mẫu A và mẫu B (p<0,05). Kết quả trên thiết bị Mastersizer 3000E cũng khá tương đồng, chỉ mẫu C xuất hiện tín hiệu tiểu phân vùng nano (chiếm tỉ lệ 35,68% ± 16,36%), còn các mẫu A và B chỉ thu được kích thước tiểu phân vùng micro trở lên. Tỉ lệ tiểu phân vùng dưới 10 μm của mẫu A và B thậm chí cịn có xu hướng giảm so với nguyên liệu, trong đó mẫu B giảm có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
pH môi trường ảnh hưởng mạnh tới mức độ tháo xoắn mạch betaglucan. Ở pH cao, nồng độ ion OH– lớn, mức độ ion hoá mạch tăng lên, tăng lực đẩy tĩnh điện giữa các mạnh và do đó tăng cường khả năng tách mạch. Ở pH trung tính hay acid, betaglucan vẫn tồn tại ở dạng xoắn ba [62, 95]. Khi ở trạng thái sợi đơn, các lực va chạm trong quá trình nghiền dễ dàng chia nhỏ tiểu phân hơn, do vậy môi trường kiềm là môi trường cho hiệu quả nghiền tốt nhất, phù hợp với kết quả thực nghiệm.
Tác nhân acid có khả năng thuỷ phân một phần betaglucan nên về lí thuyết có thể làm giảm thêm KTTP so với mơi trường trung tính. Sự khác biệt về kết quả ở đây có thể do sự xuất hiện của tương tác nào đó tăng cường kết tụ betaglucan trong môi trường acid, dẫn tới tỉ lệ tiểu phân dưới 10 μm cịn nhỏ hơn mơi trường trung tính.
Do vậy, đề tài đã lựa chọn mơi trường kiềm để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Để lựa chọn được pH tối ưu, đề tài đã tiến hành quy trình bào chế tương tự như quy trình E với các giá trị pH dịch nghiền là 11; 11,5 và 12. Kết quả được đánh giá sơ bộ trên thiết bị Mastersizer 3000E, được trình bày tại bảng PL-2.1 và hình 3.10.
33
Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH tới phân bố KTTP betaglucan
Kết quả cho thấy, khi pH tăng dần từ 11 đến 12, tỉ lệ khối lượng tiểu phân betaglucan ở vùng nano có xu hướng tăng lên. Mẫu nghiền tại pH 12 có tỉ lệ khối lượng tiểu phân ở vùng nano lớn hơn đáng kể so với vùng pH 11,5 và 11 (p<0,05). Điều này phù hợp với giả thiết pH 12 là giá trị cần thiết để quá trình tháo xoắn xảy ra hiệu quả, khi đó các lực tác động trong quá trình nghiền sẽ dễ chia nhỏ tiểu phân betaglucan hơn. Chính vì vậy, đề tài đã lựa chọn pH dịch nghiền là 12 để tiến hành các khảo sát khác.
b) Ảnh hưởng của sự có mặt của tác nhân tháo xoắn và thuỷ phân
Ảnh hưởng của sự có mặt của tác nhân tháo xoắn và thuỷ phân được đánh giá thông qua so sánh kết quả mẫu D và E so với các mẫu A, B, C và nguyên liệu. Kết quả cho thấy KTTPTB, PDI và tỉ lệ dược chất vùng nano của mẫu D, E đều nhỏ hơn so với mẫu A, B và nguyên liệu (p<0,05); so với mẫu C, KTTPTB của mẫu D và E đều nhỏ hơn (p<0,05), PDI khác biệt khơng có ý nghĩa (p>0,05) nhưng đều có xu hướng giảm, tỉ lệ dược chất vùng nano của mẫu E lớn hơn đáng kể mẫu C (p<0,05) cịn mẫu D thì khơng khác biệt (p>0,05). Như vậy, có thể thấy sự có mặt đầy đủ của tác nhân tháo xoắn và thuỷ phân là cần thiết đối với hiệu quả của quá trình nghiền.
c) Ảnh hưởng của thứ tự đưa tác nhân tháo xoắn và thuỷ phân
Từ kết quả của mẫu D và E, có thể thấy việc đưa tác nhân thuỷ phân liên kết glycosid trước tác nhân tháo xoắn cho KTTPTB nhỏ hơn và tỉ lệ tiểu phân betaglucan ở vùng nano nhiều hơn (p<0,05), PDI cũng có xu hướng giảm nhưng khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Hiện tượng này có thể được giải thích như sau: trong quy trình D, thời gian tiếp xúc giữa tác nhân thuỷ phân (acid) với betaglucan tương đối ngắn do bị trung hồ hết bởi NaOH. Đây cũng là lí do khiến KTTP quy trình D khơng khác biệt so với quy trình C. Ngược lại, với quy trình E, tác nhân acid tiếp xúc trực tiếp với betaglucan trong thời gian dài hơn, với sự hỗ trợ của nhiệt độ, phản ứng thuỷ phân liên kết glycosid xảy ra có ý nghĩa đối với quá trình làm giảm KTTP.
Như vậy, với cặp tác nhân tháo xoắn – thuỷ phân là NaOH và HCl, đề tài đã lựa chọn việc đưa tác nhân thuỷ phân trước tác nhân tháo xoắn để phát huy tối đa vai trò của
0.00 15.00 30.00 45.00 60.00 75.00 11 11,5 12 T ỉ lệ (%) Giá trị pH Vùng <1 mcm Vùng 1-10 mcm Vùng > 10 mcm
34
mỗi thành phần. Tiểu phân betaglucan thu được có KTTPTB đạt 416,4 ± 8,9 nm và tỉ lệ