VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tà
2.3.6.3.Định lượng protein theo phương pháp Bradford [13]
A618 x 10 Phycocyanin (mg/g)= 3,39 x a 13,9 x A665 x 10 Chlorophyll tổng (mg/g) = a
a) Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595nm. Độ hấp thụ ở bước sóng 595nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo mật độ quang hỗn hợp dung dịch bằng máy quang phổ kế. Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép phát hiện từ 5- 200μg protein, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
b) Cách tiến hành:
- Pha dung dịch thuốc nhuộm Bradford 1X (phụ lục 8 ) - Pha dung dịch đệm PBS 1X (phụ lục 8)
- Các bước dựng đường chuẩn:
+ Tiến hành pha loãng từ dung dịch BSA 1mg/ml để được các dung dịch BSA có nồng độ 0- 100µg/ml.
+ Dùng pipet hút dung dịch thuốc nhuộm Bradford 1X + dung dịch BSA ở các nồng độ đã pha loãng như trên theo tỷ lệ 4 : 1, để yên 10 phút.
+ Đo độ hấp thụ của dịch bằng máy Elisa reader ở bước sóng 595nm. OD = OD (595 nm) – OD (595 – BSA 0 µg/ml).
+ Dựng đường chuẩn.
- Các bước xác định lượng protein tổng từ các mẫu thí nghiệm:
+ Dùng pipet hút dung dịch thuốc nhuộm Bradford 1X + dung dịch protein theo tỷ lệ 4 : 1, để yên 10 phút.
+ Đo độ hấp thụ của dịch bằng máy Elisa reader ở bước sóng 595nm. OD = OD (595 nm) – OD (595 – BSA 0 µg/ml).
- Dựa vào đường chuẩn BSA và giá trị OD thu được suy ra lượng protein tổng của mẫu cần xác định (µg/ml).
c) Tính kết quả
Sau khi thực hiện các bước cần thiết để xây dựng đường chuẩn chúng tôi đã xây dựng được đồ thị đường chuẩn (hình 3.19).
Thay giá trị OD595nm vào đồ thị đường chuẩn có phương trình y= 0.0053x với y= OD595nm .Suy ra
0053 . 0
y
x= . Với x là số µg protein trong tảo có trong 1 ml dung
dịch.