- 39trường hợp xảy ra như sau:
NỘI DUNG 5: Knock-down gene mục tiêu trong ruồi giấm chuyển gene bằng kỹ thuật RNA
bằng kỹ thuật RNAi
5.1. Thực hiện phép lai giữa các dòng ruồi biểu hiện protein GAL4 và dòng ruồi mang phức hợp UAS ỜIR. dUCH mang phức hợp UAS ỜIR. dUCH
Trước hết, cần chọn con đực và con cái chưa giao phối (virgin) khỏe mạnh, có sức sống tốt cho tiếp xúc với nhau. Việc lựa chọn con cái là rất cần thiết để đảm bảo kiểm sốt kết quả của ph p lai. Do đó cần chọn con cái chưa giao phối với bất kỳ con đực nào. Dấu hiệu để nhận biết ruồi cái chưa giao phối là thân ruồi trắng, có một chấm đen đặc trưng ở vùng bụng (hình 16). Mỗi phép lai tiến hành theo t lệ 8 cái: 3 đực.
Hình 11. Ruồ á ư g p ối
Những ống ruồi lai được giữ ở nhiệt độ ~ 280C - nhiệt độ tối ưu cho biểu hiện, nhờ đó tạo điều kiện cho protein mục tiêu biểu hiện.
5.2. Phép lai giữa dòng ruồi GMR-GAL4 và dòng ruồi mang phức hợp UAS-IR. dUCH dUCH
- 45 -
Vì tổ hợp mang promoter GMR-GAL4 nằm trên nhiễm sắc thể X nên chúng tôi thiết lập phép lai giữa ruồi đực mang phức hợp gen UAS-IR. dUCH với ruồi cái GMR- GAL4.
Chọn ruồi chưa giao phối mang MR-GAL4, cho lai với ruồi đực của các dòng mang UAS- R.dUCH theo các sơ đồ lai sau:
Phép lai 1: P ♂ #2 -8 w;+; UAS-IR.dUCH x ♀ GMR-GAL4;+ Gt w;+; UAS-IR.dUCH GMR-GAL4;+;+ F1 GMR-Gal4/+; +; UAS-IR.dUCH/+ Phép lai 2: P ♂ #26-9 w;+;UAS-IR.dUCH/TM3 x ♀ GMR-GAL4;+ Gt w;+;UAS-IR.dUCH/TM3 GMR-GAL4;+;+ F1 GMR-Gal4/+; +; UAS-IR.dUCH/+ Phép lai 3: P ♂ CantonS +;+;+ x ♀GMR-GAL4;+;+ Gt +;+;+ GMR-GAL4;+;+ F1 ; ; 4 GAL GMR
Thu nhận F1 cho các thắ nghiệm phân t ch sâu hơn.
5.4.Kiểm tra sự biểu hiện của protein dUCH bằng estern blot
Thu nhận protein tổng từ các dòng ruồi
Nguyên tắc: Protein mục tiêu được biểu hiện ở mô, cơ quan khác nhau của ruồi.
Do đó, chúng tơi tiến hành thu nhận mô, cơ quan ác định. Sau đó phá mẫu để thu được protein mục tiêu. Có rất nhiều cách phá mẫu như dùng lực cơ học, dùng âm
- 46 -
thanh, dùng nhiệt, dùng hóa chất để phá màng tế bào giải phóng protein mục tiêu ra mơi trường. Để có được kết quả tốt, ta có thể tiến hành kết hợp các phương pháp trên.
Cách tiến hành:
Thu nhận ruồi (mỗi dịng 50 con)
Tách lấy mơ, cơ quan biểu hiện định hướng
Thêm 50ộl RIPA buffer, 1ộl NaVO3, bổ sung PMSF 1mM
Nghiền bằng chày, luôn giữ mẫu trên đá.
Sau đó phá mẫu bằng sóng siêu âm.
Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút.
Thu nhận phần dịch nổi (~ 40ộl), chú ý loại bỏ phần lipid ở trên mặt lớp dịch nổi.
Thêm dung dịch phá mẫu (sample buffer X theo đúng t lệ. orte kĩ.
Đun ở 1000C trong 30 phút. Sau đó, spin và giữ mẫu trong tủ mát.
Tiến hành điện di SDS Ờ PAG và lai estern blot như đã tr nh bày ở phần trước
5.5.Kiểm tra sự biểu hiện protein dUCH bằng miễn dịch hu nh quang trên m ruồi giấm
ước 1: Cố định mẫu
Tách cơ quan ruồi theo thiết kế th nghiệm trong PBS X, giữ trên đá.
Hút bỏ PBS, bổ sung dung dịch paraformaldehyde 5%, cố định mẫu trong 25 phút ở 250C.
Hút bỏ paraformaldehyde, rửa bằng PBS-Triton 0.3% 3 lần , mỗi lần 15 phút.
Ngâm mẫu trong dung dịch sữa gầy 5% trong 30 phút
Rửa sạch sữa gầy bằng PBS-Triton 0.3%
ước 2: Lai kháng thể đặc hiệu
- 47 -
Rửa mẫu 5 lần bằng PBS-Triton, mỗi lần 15 phút.
Khóa bề mặt mơ bằng dung dịch sữa gầy trong 30 phút.
Rửa sạch sữa gầy bằng PBS-Triton 0.3%.
Ủ mẫu trong dung dịch kháng thể 2 trong hộp tối 3 tiếng ở 250
C hoặc ủ qua đêm ở 40C.
Rửa mẫu 5 lần bằng PBS-Triton 0.3%, mỗi lần 15 phút.
Hút bỏ PBS-Triton 0.3%, bổ sung PBS 1%
ước 3: Cố định mẫu lên lam và xem kết quả dưới kắnh hiển vi hu nh quang
Nhỏ một giọt dung dịch bảo quản lên lam.
Đặt mẫu lên lam, chú ý ch nh sửa hình dạng và vị trắ của mẫu sao cho dễ quan sát.
Đậy lamel, chú ý tránh không để xuất hiện bọt khắ. Cố định
Quan sát mẫu bằng kắnh hiển vi huỳnh quang dưới bước sóng 480nm
5.6.Khảo sát khả năng vận động của các dòng ruồi chuyển gene (Climbing assay)
Cách tiến hành:
Bắt ngẫu nhiên 30 con ruồi cái, 30 con ruồi đực ở mỗi dòng cho vào các ống nghiệm riêng biệt đã đánh dấu (mỗi ống 10 con).
Cho các dòng ruồi cần khảo sát (mỗi dòng 10 con) vào các ống nhựa đã được đánh dấu mức 10cm và 20cm.
Đập nhẹ các ống ruồi để đưa ruồi về dưới đáy ống nhằm đưa chúng về cùng một đ ch xuất phát. Sau 10 giây, ghi nhận có bao nhiêu con ruồi vượt qua mức 10cm, sau 20 giây ghi nhận có bao
nhiêu con ruồi vượt qua mức 20cm. Lặp lại ba lần cho mỗi lần đo và lấy số liệu trung bình.
- 48 -
Phép đo được thực hiện cách năm ngày cho đến khi các con ruồi không di chuyển được nữa.
Vẽ đồ thị và đánh giá mức ý nghĩa bằng công cụ phân tắch t-test so sánh từng cặp của excel.