- 39trường hợp xảy ra như sau:
NỘI DUNG 3 Tạo kháng thể kháng dUCH
3.2.1. Khả á iu kiệ iểu iệ pi gp kiể g SDS-PAGE
SDS-PAGE
Ở E. coli khi biểu hiện vượt mức protein, protein có thể nằm trong pha tan hay pha tủa ở dạng thể vùi. Trong đề tài này chúng tôi mong muốn thu nhận protein trong pha tan, nhằm thu nhận protein đúng cấu hình lập thể khơng cần phải qua bước tái gấp cuộn protein. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy BL21(DE3)/pET28a/duch, cảm ứng biểu hiện protein dUCH bằng IPTG nồng độ cuối 0,5mM khi OD600 khoảng 0,8 - ,0 trong B Kana 30, ở 32oC, trong các khoảng thời gian , 2, 3, h. Thu sinh khối, phá tế bào bằng lysozyme và sóng siêu âm, thu protein tổng số, ly tâm thu 2 phân đoạn dịch nổi và tủa. Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện và tắnh tan của protein dung hợp 6 His-dUCH bằng SDS - P được trình bày trên hình 3.6.
Hình 3.6. Kết quả khả sát đ ều ki n biểu hi n protein tái tổ s-d ằng SDS-
PAGE; Giếng M: Thang protein phân tử lượng thấp; Giếng 1:
- 74 -
cảm ứng IPTG sau 1h, pha tan.; Giếng 3: BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 1h, pha t a; Giếng 4: BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 2h, pha tan; Giếng 5: BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 2h, pha t a; Giếng 6:
BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 3h, pha tan; Giếng 7:
BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 3h, pha t a; Giếng 8:
BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 4h, pha tan; Giếng 9:
BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 4h, pha t a
So sánh mẫu không cảm ứng bằng PT và các mẫu cịn lại chúng tơi nhận thấy các mẫu cịn lại có biểu hiện protein k ch thước tương đương với vạch 30kDa trong khi mẫu không cảm ứng khơng có sự biểu hiện của protein này. Tuy nhiên, protein ở pha tan tăng dần theo thới gian.
Như vậy có thể kết luận chúng tơi đã biểu hiện protein tái tổ hợp 6xHis-dUCH trong tế bào E. coli B 2 (D 3 khi được cảm ứng bằng PT và để thu nhận đủ lượng protein này trong pha tan cần tiến hành cảm ứng trong h theo các điều kiện trên. Để kh ng định rõ ràng hơn đây là protein tái tổ hợp 6xHis-dUCH, chúng tôi tiến hành lai Western blot.
3.2.2.Chứng minh sự biểu hiện của protein tái tổ hợp 6xHis-dUCH bằ g p ươ g pháp Western blot
Chúng tôi thiết kế vector tái tổ hợp nhằm biểu hiện protein dUCH dung hợp với 6 His. Đuôi 6 His này được gắn vào đầu N của protein dùng cho mục đ ch tinh chế sau này và kiểm chứng sự biểu hiện protein thông qua phương pháp lai estern Blot với kháng thể kháng His. Quy trình lai Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng His thu từ chuột và kháng thể thứ cấp là kháng thể IgG chuột có gắn với enzyme HRP. Bổ sung cơ chất và tiến hành hiện phim ghi nhận tắn hiệu lai. Kết quả được trình bày trên hình 3.7.
- 75 -
Hình 3.7. Kết quả khả sát đ ều ki n biểu hi n protein tái tổ 6xHis-dUCH
(A) Kết quả đ n di SDS-PAGE, (B) Kết quả lai Western blot với kháng thể kháng His. Giếng M: Thang protein phân tử lượng thấp; Giếng 1: BL21(DE3)/pET28a/duch không cảm ứng IPTG; Giếng 2: BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 1h, pha tan; Giếng 3: BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 1h, pha t a; Giếng 4:
BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 2h, pha tan; Giếng 5:
BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 2h, pha t a; Giếng 6:
BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 3h, pha tan; Giếng 7:
BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 3h, pha t a; Giếng 8:
BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 4h, pha tan; Giếng 9:
BL21(DE3)/pET28a/duch cảm ứng IPTG sau 4h, pha t a
So sánh tắn hiệu lai với kết quả điện di SDSỜPAGE cho thấy tắn hiệu lai tương ứng với kết qua SDS-PAGE. Vạch tắn hiệu tương ứng với k ch thước xấp x 30kDa, phù hợp với k ch thước dự đoán của protein 6xHis-dUCH. Giếng 1 là
- 76 -
BL21(DE3)/pET28a/duch khơng cảm ứng, khơng có tắn hiệu, cho thấy promoter được kiểm soát chặt.
Như vậy, chúng tôi đã biểu hiện thành công protein tái tổ hợp 6xHis-dUCH trong chủng E.coli B 2 (D 3 khi được cảm ứng bằng ITGP nồng độ cuối 0,5mM.
3.3.Tinh chế thu nhận protein tái tổ hợp 6xHis-dUCH
Dòng tế bào E.coli BL21(DE3)/pET28a/duch được cảm ứng biểu hiện theo điều kiện khảo sát trên với lượng lớn và thu nhận protein tổng số. Protein duch dung hợp với 6 His được tinh chế từ protein tổng số bằng phương pháp sắc ký ái lực sử dụng cột Ni - NTA có ligand ái lực cao với His theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả của quá trình tinh chế được trình bày trong hình 3.8.
Hình 3.8. Kết quả tinh chế 6xHis-dUCH. Giếng M: Thang protein phân tử lượng thấp;
Giếng 1: Dung d p te n tổng t ướ k ột; Giếng 2: Dung d ch ra khỏ ột s g đ ạn B nd ng; Giếng 3: Dung d ch ra khỏ ột s g đ ạn s ; Giếng 4, 5, 6,
7: Dung d p te n t đượ s l g ả
Quan sát kết quả chúng tôi thấy giếng số 4, 5, 6, 7 (protein thu được sau khi ly giải có một vạch protein tương ứng với kắch thức 30kDa và tương ứng với k ch thước
- 77 -
của protein mục tiêu. Tuy nhiên ở giếng , chúng tôi nhận thấy lượng protein cao nhất nên chúng tôi chọn phân đoạn này sử dụng cho các thắ nghiệm tiếp theo.
Như vậy chúng tôi đã tinh chế thành cơng protein 6xHis-dUCH. Tiếp theo đó, chúng tôi tiến hành thẩm tắch nhằm làm giảm lượng muối, đưa về điều kiện sinh lý, đo hàm lượng protein và tiêm thỏ gây đáp ứng miễn dịch để tạo kháng thể kháng dUCH.
Bảng 3.1: Kết quả đ nồng độ protein sau tinh chế
Lần đo Nồng độ ộg/ml
Đo lần 1 660,4
Đo lần 2 674,9
Đo lần 3 670,7
Trung bình 668,7
3.4. Kiểm tra khả năng đáp ứng của kháng huyết thanh thu được bằng ISA
Tiến hành kiểm tra kháng thể thu được bằng S . Kháng nguyên là protein dUCH được pha loãng bậc hai từ nồng độ 10.00-15.63 ng và cố định trên mỗi giếng của đĩa S giảm dần từ hang đến G, hàng H có nồng độ protein bằng 0 , ch bổ sung đệm phủ giếng, làm mẫu chứng không (blank . Kháng huyết thanh thỏ thu nhận được pha loãng từ / 0.000 đến /6 0.000, đồng thời thực hiện mẫu huyết thanh thỏ tiêm protein dUCH ( /8.000 là đối chứng âm cho khả năng phản ứng của huyết thanh thỏ ban đầu với kháng nguyên mục tiêu (protein dUCH . Mức độ phản ứng của kháng huyết thanh với kháng nguyên protein dUCH được thể hiện qua kết quả đo mật độ quang ở bước sóng 92 (OD492 của các mẫu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.9.
- 78 - ả g 3.2: Kết ả t ử ng m SA t ên k áng ết t n t đượ vớ nồng độ