- 8 0 ả g 3.3: Kết ả t ử ng m SA t ên k áng ết t n t đượ vớ nồng độ
NỘI DUNG 5: Knockdown gene mục tiêu trong ruồi giấm chuyển gene bằng kỹ thuật RNA
bằng kỹ thuật RNAi
Sau khi kiểm tra hiệu quả knoc-down gene dUCH trong các dòng ruồi chuyển gene, chúng tơi thực hiện các ph p lai các dịng ruồi UAS-IR. dUCH với các dòng ruồi biểu hiện protein ở các mô khác nhau. Mục đ ch của việc thực hiện ph p lai này là kết hợp sử dụng hệ thống U S Ờ , giúp knoc-down gene dUCH tại các mô đ ch khác nhau. Trong th nghiệm này, chúng tôi sử dụng các dòng ruồi GAL4 biểu hiện định hướng mô mắt và mô não.
5.1.Knock-down dUCH định hướng tại mơ mắt với dịng ruồi GMR_GAL4
GMR_GAL4 là dòng ruồi mang promoter chuyên biệt cho mô mắt GMR. Sử dụng dòng ruồi này cho phép xem xét sự knock-down gene mục tiêu ở đĩa phân sinh mắt ruồi, hình thái mắt ở ruồi trưởng thành, cũng như phân t ch sâu hơn về tác động của protein mục tiêu (dUCH) trên chu trình tế bào và sự biệt hóa các tế bào ở mức độ mơ phân sinh.
Chúng tôi thiết kế các phép lai nhằm thu nhận các cá thể ruồi chuyển gen mang đồng thời hai yếu tố UAS-IR. dUCH và GMR- trong cơ thể. Các ph p lai được tiến hành dựa trên các ch thị trên nhiễm sắc thể ruồi giấm (balancer (như đã trình bày ở phần ậ iệu Ờ P ươ g p áp và thu được kết quả như sau:
Ph p lai Kiểu gen ruồi 1 Kiểu h nh ruồi 1
Phép lai 1:
♂ Canton S GMR-Gal4/+;+; +/+ Mắt đỏ, bình thường
Phép lai 2:
- 88 -
Phép lai 3:
♂ #26-9
GMR-Gal4/+;+; UAS-IR.dUCH/+ Mắt đỏ, nhám nhiều
GMR-Gal4/+;+; TM3/+ Mắt đỏ, bình thường, khơng có lơng lưng, cánh lẹm
Các cá thể ruồi lai mang U S Ờ IR. dUCH và MR được lựa chọn dựa vào kiểu hình của marker. Sau đó, chúng tơi phân t ch kiểu hình ruồi và các ảnh hưởng của sự knock-down trong ruồi chuyển gene.
Kết quả phân tắch cho thấy, sự knock-down dUCH trong mô mắt ruồi chuyển gene làm sự phát triển mắt ruồi diễn ra khơng bình thường, ghi nhận đầu tiên về biểu hiện kiểu hình cho thấy mắt ruồi trở nên nhám trong các ruồi lai mang Gal4-UAS.IR- dUCH, kiểu hình này khơng cịn nữa khi chúng tơi tăng cường biểu hiện dUCH trong mô mắt ruồi nhằm bù đắp lượng mRNA dUCH bị phân giải do hiệu quả knoc-down. Kết quả này kh ng định hậu quả biến đổi kiểu hình mắt ruồi thành mắt nhám là do sự knock-down dUCH (hình 5.1)
- 89 -
Bên cạnh kết quả phân tắch kiểu hình mắt ruồi, chúng tơi cũng thực hiện nhuộm miễn dịch đĩa phân sinh mắt ruồi với kháng thể kháng dUCH để kiểm tra sự biểu hiện protein dUCH. Kết quả cũng cho thấy, protein dUCH trong đĩa tiền phân sinh mắt ruồi chuyển gene mang UAS Ờ IR. dUCH giảm nhiều so với ruồi đối chứng. Sự biểu hiện protein dUCH được khôi phục trong ruồi mang UAS- IR.dUCH>UAS.dUCH (hình 5.1)
Hình 5.2. Kiểm tra sự biểu hi n c a protein dUCH trong mô tiền phân sinh mắt ruồi
5.2.Knock-down dUCH định hướng tại m não với d ng ruồi Ddc-GAL4
Ddc-GAL4 là dòng ruồi mang promoter Ddc chuyên biệt biểu hiện trong các tế bào thần kinh sản sinh dopamine. Kết hợp sử dụng dòng ruồi này và dòng ruồi mang UAS-IR. dUCH cho phép xem xét knock-down gene mục tiêu ở mô não, và ảnh hưởng trên hình thái ruồi trưởng thành.
Chúng tơi thiết kế các phép lai nhằm thu nhận các cá thể ruồi chuyển gen mang đồng thời hai yếu tố UAS-IR. dUCH và Ddc- trong cơ thể và thu được kết quả như sau:
Ph p lai Kiểu gen ruồi 1 Kiểu h nh ruồi 1
Phép lai 1:
- 90 -
Phép lai 2:
♂ #24-8 +;Ddc-Gal4/+; UAS-IR.dUCH/+ Bình thường
Phép lai 3:
♂ #26-9
+;Ddc-Gal4/+; UAS-IR.dUCH/+ Bình thường
+;Ddc-Gal4/+; TM3/+ Khơng có lơng lưng, cánh lẹm
Các cá thể ruồi lai mang cả UAS-IR. dUCH và Ddc- được lựa chọn dựa vào kiểu hình như đã trình bày ở trên. Sau đó, chúng tơi tiến hành nhuộm miễn dịch não ruồi trưởng thành với kháng thể kháng dUCH. Kết quả nhuộm miễn dịch cho thấy protein dUCH giảm biểu hiện trong ruồi mang Ddc-Gal4>UAS-IR.dUCH (hình 5.3.)
Hình 5.3. Kiểm tra sự biểu hi n c a protein dUCH trong não ruồi
Song song đó, chúng tơi cũng tiến hành phân tắch kiểu hình của ruồi chuyển gene mang phức hợp Ddc-Gal4>UAS-IR.dUCH bằng các thắ nghiệm phân tắch khả năng vận động của ruồi. Các thắ nghiệm này được tiến hành ở giai đoạn ấu trùng bậc 3 của ruồi và trên ruồi trưởng thành ở các ngày tuổi khác nhau.
- 91 -