Động vật thắ nghiệm

PHẦN 3 : THỰC NGHIỆM

3.4 Đánh giá hoạt tắnh chống viêm của cao chiết phân lập được từ lá cây Thóc lép

3.4.2 Động vật thắ nghiệm

- Chuột cống trắng, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 150 Ử 20 gam (để

nghiên cứu tác dụng chống viêm), đạt tiêu chuẩn thắ nghiệm do Viện Vệ sinh dịch

tễ Trung ương cung cấp.

3.4.3 Phương pháp nghiên cứu :

3.4.3.1 Tác dụng kháng viêm cấp theo đường uống :

- Tiến hành trên mơ hình gây phù chân chuột bằng carrageenin theo phương pháp Winter.

- Chuột được gây viêm bằng cách tiêm carrageenin 1% (pha trong nước muối sinh lý) 0.05ml/chuột vào gan bàn chân sau, bên phải của chuột.

- Sau đó đo thể tắch chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng dụng cụ chuyên biệt (Plethysmometer).

- Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con. Lô 1 (lô chứng sinh học) : uống nước cất 1,0ml/100g. Lô 2 (lô chứng dương) uống aspirin 150 mg/kg/ngày. Lô 3 (lô TL liểu thấp): uống TL 100mg/kg/ngày. Lô 4 (lô TL liểu cao): uống TL 300mg/kg/ngày.

- Đo thể tắch chân chuột vào các thời điểm: trước khi gây viêm (V0) , sau khi gây viêm 2 giờ (V1), 4 giờ (V2), 6 giờ (V3), và 24 giờ (Vt).

- Kết quả độ tăng thể tắch chân chuột được tắnh theo công thức Fontaine : V% = 100x (Vt-V0)/Vx

Trong đó: V% : độ tăng thể tắch chân chuột.

Vt: thể tắch chân chuột sau khi gây viêm.

- Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh gia bằng khả năng ức chế phản ứng phù (I%).

I% = 100 x ( - )/

Trong đó: I% : khả năng ức chế phản ứng phù (%).

: trung bình độ tăng thể tắch chân chuột ở lơ chứng (%). : trung bình độ tăng thể tắch chân chuột ở lơ uống thuốc (%). 3.4.3.2 Tác dụng chống viêm mạn tắnh:

- Tiến hành trên mơ hình gây u hạt thực nghiệm bằng amiant. Gây u hạt

thực nghiệm theo phương pháp của Ducrot, Julou và cộng sự trên chuột cống trắng. Amiant được viên thành hạt hình cầu nhỏ trọng lượng 30,0 Ử 1,0 mg, tiệt khuẩn bằng nhiệt độ cao (160oC / 2 giờ) trước khi cấy vào cơ thể chuột cống.

- Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 8 con. Lô 1 (lô chứng sinh học): uống nước cất. Lô 2 (lô chứng dương): uống prednisolon 5,0 mg/kg/ngày. Lô 3 (lô TL liều thấp): uống TL 100 mg/kg/ngày. Lô 4 (lô TL liều cao): uống TL 300 mg/kg/ngày.

- Chuột được gây viêm mạn bằng cách cấy vào dưới da gáy của chuột viên amiant đã nhúng vào carrageenin 1%.

- Sau khi cấy cho chuột uống thuốc trong 5 ngày.

- Ngày thứ 6 gây mê chuột bằng ether, bóc tách khối u hạt, sấy ở nhiệt độ 56oC trong 18 giờ.

- So sánh trọng lượng trung bình của khối u hạt (đã trừ trọng lượng amiant) giữa các lô uống thuốc và đối chứng.

- Tác dụng chống viêm được biểu thị bằng tỉ lệ % giảm trọng lượng khối u. - Các số liệu được sử lắ trên Excel, thuật toán thống kê student t’ test, F’test và phương pháp phân tắch phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA) để kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng âm, với p < 0.05 được coi là sai khác có ý nghĩa. % VC  Vt% VC% % VC  % Vt 

3.5 Thử nghiệm hoạt tắnh gây độc tắnh cấp trên chuột 3.5.1 Nguyên liệu : 3.5.1 Nguyên liệu :

- Mẫu thử ở dạng cao chiết tổng ethanol (ký hiệu là TL), màu đen, được chiết tách từ lá Thóc lép, do phịng Hóa dược, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên cung cấp.

3.5.2 Động vật thắ nghiệm :

- Loài: Chuột nhắt trắng thuần chủng dòng BALB/c - Cân nặng: 20 Ử 2g

- Số lượng: 42 con chuột

- Nguồn gốc: Phịng Thử nghiệm sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học - Điều kiện chăm sóc: ĐVTN được ni trong điều kiện chuồng thoáng mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu của chuột.

- Cân nặng: Tất cả ĐVTN trước khi tiến hành thắ nghiệm được xác định cân nặng.

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu :

- Quy trình nghiên cứu được chia ra làm 2 thử nghiệm chắnh là thử nghiệm sơ bộ và thử nghiệm chắnh thức.

Nguyên lý:

-Nguyên tắc: Cho chuột thử nghiệm uống cùng liều mẫu nghiên cứu trong

điều kiện ổn định như nhau, quan sát các phản ứng xảy ra trong 72h.

Thử nghiệm sơ bộ: Cho 6 chuột (50% đực, 50% cái) nhịn đói ắt nhất 12 giờ

trước khi cho uống mẫu nghiên cứu ở liều duy nhất, tối đa có thể, qua đường uống (thể tắch tối đa là 0,2 ml-0,75 ml/10g trọng lượng chuột Ố theo ỀHướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệuỂ của Bộ y tế ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015) [8]. Theo dõi và ghi nhận cử động tổng quát, biểu hiện về hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiểu tiện và số lượng chết của chuột trong vịng 72 giờ, chuột khơng có dấu hiệu bất thường hoặc chết, tiếp tục theo dõi trong 14 ngày.

Thử nghiệm chắnh thức: Có 3 trường hợp có thể xảy ra:

Trường hợp 1: Sau khi cho chuột uống mẫu, số chuột trong lô thử vẫn bảo

tồn cho thấy liều cao nhất có thể qua kim mà không làm chuột chết. Liều này được kắ hiệu là Dmax và liều tương đối an tồn Ds dùng trong các thử nghiệm dược lý có thể bằng hoặc lớn hơn 1/5 Dmax.

Trường hợp 2: Sau khi cho chuột uống mẫu nghiên cứu, tỉ lệ tử vong là

100% thì thử với liều giảm Ỏ so với liều đầu. Tiếp tục thăm dị cho đến khi tìm được liều tối thiểu gây chết 100% chuột (LD100) và liều tối đa không gây chết con nào (LD0). Tiến hành thử nghiệm xác định LD50 theo phương pháp của Dodehe Yeo và cộng sự (2012) [81], N’dia Kouadio Frédéri và cộng sự (2013) [82], Aristide Traore và cộng sự (2014) [83].

Trường hợp 3: Sau khi uống mẫu thử, số chuột tử vong thấp hơn 100%,

không xác định được liều gây chết tuyệt đối (LD100) dẫn tới không thể xác định được LD50. Tuy nhiên, trường hợp này có thể xác định được liều tối đa khơng gây chết chuột, gọi là liều dưới liều chết (LD0). Khi đó liều tương đối an tồn Ds dùng trong các thử nghiệm dược lý có giá trị bằng 1/5 hoặc 1/10 liều LD0.

3.5.3.1. Thử sơ bộ

Cách xử lắ và chuẩn bị mẫu thử: Cặn chiết được pha trong cồn, sau đó giảm nồng độ cồn và cho chuột uống liều tối đa 5000 mg/kg trọng lượng chuột.

Kết quả thử nghiệm sơ bộ cho thấy có khơng có chuột bị chết trong vịng 72 h. Như vậy, thắ nghiệm được tiếp tục thực hiện theo trường hợp 1.

3.5.3.2.Thử nghiệm chắnh thức Bố trắ thắ nghiệm:

36 chuột nhắt trắng dòng BALB/c khoẻ mạnh, khối lượng khoảng 19-21 gram, không phân biệt giống, được nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học trong điều kiện tiêu chuẩn về nhiệt độ, ánh sáng, được chia làm 6 lơ (6 chuột/lơ), và bị bỏ đói hồn tồn 16 giờ trước khi được uống chế phẩm TL. Chuột được theo dõi cân nặng và biểu hiện sinh lý trong khoảng thời gian 2 giờ sau khi uống và ở các thời điểm trước khi uống mẫu, ngày 1, ngày 4 và ngày 7. Các số liệu được xử lắ trên Excel, được trình bày dạng Mean Ử SE.

- Lô 1: (đối chứng sinh lý) Uống cồn thực phẩm pha ở 10% liều 0,3- 0,4 ml/con - Lô 2: Uống TL liều 1000mg/kg trọng lượng cơ thể

- Lô 3: Uống TL liều 2000 mg/kg trọng lượng cơ thể - Lô 4: Uống TL liều 3000 mg/kg trọng lượng cơ thể - Lô 5: Uống TL liều 4000 mg/kg trọng lượng cơ thể - Lô 6: Uống TL liều 5000 mg/kg trọng lượng cơ thể

Công thức tắnh giá trị LD50

Xác định LD50 được tiến hành theo phương pháp của Karber Behrens (trắch theo Dodehe Yeo và cs, 2012 và trắch theo Shetty Akhila J và cs, 2007) [81,83] như sau:

LD50 = LD100 - ΣaÈb/N Trong đó: LD50: LD100: N: a: b: Liều chết 50% động vật thắ nghiệm Liều thấp nhất gây chết 100% động vật thắ nghiệm Số động vật trong một nhóm

Sự khác biệt về liều giữa hai liều liên tiếp Tỷ lệ tử vong trung bình của hai nhóm liên tiếp Lịch theo dõi: Theo dõi biểu hiện của chuột sau khi uống, trong vòng 2 giờ đầu và theo dõi hoạt động của ĐVTN trong thời gian 7 ngày sau khi uống. Xác định khối lượng chuột tại các thời điểm ngay trước khi uống, 1 ngày, 4 ngày và 7 ngày sau khi uống mẫu thử.

3.6 Dữ liệu phổ các chất phân lập được

3.6.1. Dữ liệu phổ của hợp chất DG-1 (Luteolin) C15H10O6 (M = 286)

 Tinh thể hình kim, màu vàng , tnc = 328-330oC.  Khối lượng 10mg.

 Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD),  (ppm):

6,23 (1H, d, J = 1,5 Hz, 6-CH); 6,46 (1H, d, J = 1,5 Hz, 8-CH); 6,56 (1H, s, 3-CH); 6,92 (1H, d, J = 8,5 Hz, 5’-CH); 7,40 (2H, m, 2’,6’-CH)

166,12 (C-2); 103,88 (C-3); 183,87 (C-4); 163,21 (C-5); 100,17 (C-6); 166,37 (C-7); 95,03 (C-8); 159,43 (C-9); 105,30 (C-10); 123,72 (C-1’); 114,18 (C- 2’); 147,05 (C-3’); 151,01 (C-4’); 116,80 (C-5’); 120,31 (C-6’).

3.6.2. Dữ liệu phổ của hợp chất DG-11 (Luteolin tetramethyl ether) C19H18O6 (M = 342). (M = 342).

 Tinh thể hình kim, màu trắng, tnc = 195-197 oC.  Khối lượng 6,5mg.  Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD),  (ppm): 6,56 (1H, d, J = 2,0 Hz, 6-CH); 6,67 (1H, s, 3-CH); 6,85 (1H, d, J = 2,5 Hz, 8- CH); 7,14 (1H, d, J = 7,5 Hz, 5’-CH); 7,53 (1H, d, J = 2,0 Hz, 2’-CH); 7,64 (1H, dd, J = 7,5, 2,0 Hz, 6’-CH); 3,94 (6H, s, 3’,5-CH3); 3,97 (3H, s, 4’-CH3) 3,98 (3H, s, 7-CH3).  Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD),  (ppm): 180,07 (C-4); 166,49 (C-7); 163,46 (C-2); 162,09 (C-5); 161,37 (C-9); 153,82 (C- 3’); 150,88 (C-4’); 124,83 (C-1’); 121,20 (C-6’); 112,81 (C-5’); 110,48 (C-2’); 107,62 (C-3); 97,43 (C-6); 94,27 (C-8); 56,76 (CH3O-4’); 56,59 (CH3O-3’,5) 56,54 (CH3O-7).

3.6.3. Dữ liệu phổ của hợp chất DG-2 (Protocatechuic acid) C7H6O4 (M=154).

 Tinh thể hình kim, màu trắng, tnc = 219-221 oC  Khối lượng 12mg.  Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD),  (ppm): 6,79 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5); 7,43 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6); 7,47 (1H, s, H-2);  Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD),  (ppm): 169,01 (C-7); 150,45 (C-4); 145,73 (C-3); 123,62 (C-6); 123,60 (C-1); 117,87 (C-5); 115,54 (C- 2);

3.6.4 Dữ liệu phổ của hợp chất DG-7 ((6S,9R)-roseoside) C19H30O8 (M = 386).

 Chất rắn vô định hình, khơng màu, tan tốt trong methanol, tnc = 207- 208 oC.

 Khối lượng 9mg.

 Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD),  (ppm): 1,05 (3H, s, 12-CH3);

41 CH3); 2,18 (1H, d, 17,0, 2-CH2); 2,55 (1H, d, 17,0, 2-CH2); 3,20 (1H, m, 2’-CH); 3,24 (1H, m, 5’-CH); 3,29 (1H, m, 4’-CH); 3,35 (1H, m, 3’-CH); 3,65 (1H, m, 6’-CH2); 3,87 (1H, d, 2,0, 15,0, 6’-CH2); 4,36 (1H, d, 7,5, 1’-CH); 4,44 (1H, m, 9-CH); 5,87 (1H, m, 8-CH); 5,88 (1H, brs, 4-CH); 5,89 (1H, m, 7-CH).  Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD),  (ppm): 201,36 (C-3); 167,34 (C-5); 135,26 (C-7); 131,55 (C-8); 127,18 (C-4); 102,72 (C-1’); 80,01 (C-6); 78,08 (C-3’); 78,00 (C-5’); 77,33 (C-9); 75,24 (C-2’); 71,63 (C-4’); 62,79 (C-6’); 50,69 (C-2); 42,43 (C-1); 24,67 (C-12); 23,42 (C-11); 21,19 (C-10); 19,57 (C-13).

3.6.5 . Dữ liệu phổ của hợp chất DG-12 (Rutin) C27H30O16 (M = 610)

 Bột vơ định hình màu vàng, tnc = 240-242 oC.  Khối lượng 15mg.  Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD),  (ppm): 7,69 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2’); 7,65 (1H, dd, J = 8,5, 2.0 Hz, H-6’); 6,90 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 6,42 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 5,13 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1Ể); 4,54 (1H, m, H-1Ể’); 3,40 Ố 3,90 (10H, rhamnose and glucose); 1,14 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6Ể’).  Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD),  (ppm): 179,42 (C-4); 166,01 (C-7); 162,97 (C-5); 159,34 (C-9); 158,51 (C-2); 149,80 (C-4’); 145,83 (C-3’); 135,63 (C-3); 123,56 (C-6’); 123,14 (C-1’); 117,71 (C-2’); 116,07 (C-5’); 105,64 (C-10); 104,71 (C-1Ể); 102,42 (C-1Ể’); 99,96 (C-6); 94,88 (C-8); 78,19 (C-3Ể); 77,22 (C-5Ể); 75,73 (C-2Ể); 73,95 (C-4Ể’); 72,26 (C-3Ể’); 72,10 (C-3Ể’); 71,41 (C-4Ể); 69,71 (C- 5Ể’); 68,56 (C-6Ể); 17,87 (C-6Ể’).

PHẦN 4 : KẾT QUẢ Vầ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả đánh giá hoạt tắnh gây độc cấp của cao chiết Thóc lép

Với sự bố trắ thắ nghiệm ở trên chúng tôi thu được kết quả độc tắnh cấp theo đường uống của mẫu nghiên cứu như sau:

Bảng 4.1.1. Số lượng chuột chết, biểu hiện bên ngoài của chuột khi uống thuốc thử

Lô Mẫu TL (mg/kg)

số chuột chết trong 72 giờ

Biểu hiện bên ngồi trong vịng 0-72 giờ

1 Đối chứng 0

Sau khi uống nước chuột di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ

ánh sáng và âm thanh tốt

2 1000 0