1.1.2.3 Xét nghiệm tinh dịch đồ
Xét nghiệm TDĐ là một thăm dò bắt buộc cho tất cả các cặp vợ chồng hiếm muộn vì xét nghiệm này đơn giản, dễ làm, không tốn kém, không xâm nhập. Không sinh hoạt tình dục từ 2 đến 7 ngày trước xét nghiệm. Mẫu tinh dịch được lấy bằng thủ dâm, chờ 30 phút để cho tinh dịch li giải hoàn toàn, sau đó đọc dưới kính hiển vi. Tổ chức y tế thế giới đã tái bản cẩm nang về TDĐ 5 lần. Bảng dưới đây so sánh tiêu chuẩn chỉ số TDĐ bình thường hai lần tái bản gần đây nhất [43, 45].
Bảng 1.1 Chỉ số TDĐ bình thường theo tiêu chuẩn WHO 2010
Chỉ số TDĐ WHO 2010 Thể tích > 1,5ml pH > 7,2 Mật độ > 15.106/ml Tổng số tinh trùng > 39.106 Tinh trùng sống > 58% Di động PR (Progressive) > 32% hoặc PR +NP > 40% Hình thái bình thường > 4% T b o tr n à < 1000
1.1.2.4. Phân loại TDĐ ấ b t thường theo WHO (2010)
Aspermia Khơng có tinh dịch
Oligospermia Thể tích xuất tinh thấp (thể tích tinh dịch <1,5 ml)
Oligozoospermia Mật độ tinh trùng ít (mật độ tinh trùng <15 triệu/ml)
Asthenozoospermia Tinh trùng yếu (di động PR<32%)
Teratozoospermia Tinh trùng dị dạng (hình dạng bình thường <4%)
Oligo-astheno-
teratozoospermia Tinh trùng ít, yếu, dị dạng
Hematospermia Tinh dịch có máu (có hồng cầu trong tinh dịch).
Cryptozoospermia
1.1.3. Phương pháp ICSI.
1.1.3.1. Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI).
❖ Chỉ định tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn [46]
- Vơ sinh do chồng: các trường hợp tinh trùng ít, tinh trùng bất thường hay tinh trùng di động kém trong mẫu tinh dịch.
- Tinh trùng lấy từ mào tinh, tinh hoàn.
- Các trường hợp xuất tinh ngược dịng có thể lấy nước tiểu sau khi xuất tinh, ly tâm để lọc lấy tinh trùng.
- Các trường hợp chu kỳ IVF trước đó có tỷ lệ thụ tinh thấp. - Các trường hợp vợ lớn tuổi.
❖ Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn.
Trước khi kỹ thuật ICSI được giới thiệu, có nhiều kỹ thuật hỗ trợ thụ tinh được thử nghiệm và công bố, gồm kỹ thuật vi thao tác ph u t ch m t ph n m ng ẫ í ộ ầ à zona (partial zona dissection - PZD), kỹ thuật tiêm tinh trùng vào dưới màng zona (subzonal sperm injection - SUZI). Tuy nhiên, k t qu ế ả của các k thu t n y không ỹ ậ à được khả quan nên ít được áp dụng, ng y nay à các kỹ thuật PZD, SUZI không c n ò được th c hi n [15, 46]. ự ệ
Kỹ thuật ICSI được Palermo giới thiệu năm 1992 Đến nay kỹ thuật . ICSI được áp dụng một cách rộng rãi tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới. Chỉ định của kỹ thuật ICSI được mở rộng, đặc biệt là các trường hợp vô sinh nam [45].
c ti n h nh trên k nh hi c.
Kỹ thuật ICSI đượ ế à í ển vi có gắn hệ thống vi thao tá Nỗn đã được tách tế bào hạt, đặt trên đĩa ICSI v gi b ng kim gi à ữ ằ ữ sao cho cực dưới noãn tiếp xúc với đáy đĩa, c c c u n m v tr 6 gi ho c 12 gi ự ầ ằ ở ị í ờ ặ ờ nhằm tránh làm tổn thương thoi vô sắc khi chọc kim vào bào tương noãn [48].
Tinh trùng được h t v o kim tiêm noú à ãn, bơm đẩy ra s t phá ía đầu kim. Đẩy kim tiêm v o th ng mà ẳ àng bào tương noãn, khi đầu kim tiêm vào đến kho ng giả ữa no n th m ng no n s b ng (quan sát th y m ng nỗ ì à ã ẽ ị thủ ấ à ãn vị trí chọc kim rung lên, bào tương và tinh tr ng b ù ị đẩy ngược tr l i l ng kim tiêm). Sau khi r t kim, quan ở ạ ò ú s t l i ch á ạ ỗchọc, v ịtríchọc ph i c h nh n n vả ó ì ó ới đỉnh n n quay v o ph a trong no n, ó à í ã
n u quan s t thế á ấy đỉnh nón quay ra ngồi th ì nguy cơ bào tương nỗn s b r r qua ẽ ị ị ỉ lỗ chọc [48].
Hình 1.3. Tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn; Độ phóng đại 400X
Nguồn: Bv Bưu Điện 1.1.3.2. m tra th tinh sau làm ICSI. Kiể ụ
Quá trình thụ tinh trong t nhiên và IVF c n tr i qua các giai ự ổ điể ả đoạn: (1) tinh trùng g n màng trong su t, (2) ph n ng cắ ố ả ứ ực đầu, (3) xâm nh p vào màng trong ậ suốt, (4) hịa màng bào tương nỗn và tinh trùng, (5) hoạt hóa nỗn và (6) s hình ự thành và hịa nhập c a 2 ti n nhân. ủ ề
Trong kỹ thu t ICSI, m t tinh trùng s ậ ộ ẽ được bất động, thu gi b ng m t vi ữ ằ ộ kim, và được tiêm thẳng vào bào tương của noãn. S th tinh trong ICSI di n ra ự ụ ễ khác với bình thường do khơng có các rào c n sinh hả ọc bên ngoài như: lớ ếp t bào h t quanh noãn, màng trong suạ ốt, màng bào tương khơng cịn tác dụng chọ ọn l c tinh trùng. Do đó q trình thụ tinh trong ICSI ch bỉ ắt đầu b ng hiằ ện tượng ho t hóa ạ nỗn và hình thành ti n nhân [19]. ề
•Hoạt hóa nỗn:
Việc bất động tinh trùng trong k thu t ICSI s gây ra nh ng tỹ ậ ẽ ữ ổn thương màng bào tương tinh trùng. Nhờ đó nhân tinh trùng ti p xúc v i các nhân t giế ớ ố ải cô đặc nhân tinh trùng (glutathione) trong bào tương nỗn. Đồng thời, tinh trùng cũng giải phóng vào bào tương noãn mộ ốt s nhân t , quan tr ng nh t PLCzeta (phospholipase ố ọ ấ C), nhân t này không hoố ạt động được khi t bào ch PLCzeta t tinh trùng làm ế ết. ừ s n sinh IP3 (inisitol trisphosphate) kích thích gi i phóng ion Caả ả 2+ n i bào t các ộ ừ
bào quan bên trong noãn (mạng lưới n i ch t) giúp cho nỗn có th p t c phát ộ ấ ể tiế ụ triển, quá trình th ụ tinh sau ICSI được diễn ra [40, 59].
•S h p nh t tinh trùng vự ợ ấ ới nỗn hình thành tiền nhân sau ICSI:
S h p nh t c a tinh trùng v i noãn kèm theo gi i nén ch t nhi m s c x y ra ự ợ ấ ủ ớ ả ấ ễ ắ ả trong t bào ch t cế ấ ủa noãn trưởng thành. Các ti n nhân bề ắt đầu được hình thành 5- 6 gi sau ICSI. Hai tiờ ền nhân được hình thành khơng đồng b , tiộ ền nhân đực được hình thành trước ti n nhân cái. Tiề ền nhân đực có th nh n biể ậ ết được nh các ph n ờ ầ cịn sót l i c a tinh trùng bám vào. Nguyên nhân c a s ạ ủ ủ ự không đồng b ộ này chưa được hi u h t [32]. ể ế
Đánh giá thụ tinh trong ICSI
Thụ tinh trong ICSI thường được đánh giá vào thời điểm 16- 20 gi sau khi ờ ICSI v i s xuớ ự ất hiện của tiền nhân và th c c th 2. ể ự ứ
Hợp tửđược đánh giá bình thường có 2 tiền nhân và 2 thể c c. Nhự ững đặc điểm của 2 tiền nhân vào ngày kiểm tra thụ tinh như: kích thước và v trí 2 tiị ền nhân trong bào tương noãn, số ng và s phân b c a hlượ ự ố ủ ạt nhân, hình thái bào tương nỗn được xem là có giá tr ị tiên lượng kết quả thụ tinh tốt hay xấu [ ]11 .
Hình 1.4. Hình thái thụ tinh của hợp tử. Độ phóng đại 400X
A: Thụ tinh bình thường 2 ti n nhân. B: Th tinh bề ụ ất thường 3 ti n nhân ề C: Thụ tinh bất thường 1 ti n nhân ề
Nguồn: Bv Bưu Điện
M t trong nh ng bộ ữ ất thường th tinh quan sát th y là s xu t hi n c a nhiụ ấ ự ấ ệ ủ ều hơn 2 tiền nhân (PN- pronucleic). Có nhi u nguyên nhân dề ẫn đến hiện tượng này như: khơng phóng thích thể ự c c th hai, hoứ ặc đa thụ tinh (tiêm nhi u tinh trùng vào ề cùng m t noãn). S xu t hi n c a 1 PN vào thộ ự ấ ệ ủ ời điểm th ụ tinh cũng là một trường h p bợ ất thường th tinh. Phân tích di truy n h p t 1PN cho th y kho ng 50% các ụ ề ở ợ ử ấ ả
c A
trường h p mang b nhi m s c th ợ ộ ễ ắ ể đơn bội. Đây là kết qu c a hiả ủ ện tượng trinh s n, ả t c là nỗn t ho t hóa mà khơng c n tinh trùng. Nhứ ự ạ ầ ững trường h p còn l i là do s ợ ạ ự phát triển không đồng b c a ti n nhân (ti n nhân th ộ ủ ề ề ứ hai, thường là tiền nhân đực, s xu t hi n m t vài gi ẽ ấ ệ ộ ờ sau đó) hoặc do s hịa màng s m c a hai tiự ớ ủ ền nhân (trường h p này h p t mang b ợ ợ ử ộ NST lưỡng b [19]. ội)
1.1.4. S phát triự ển của phôi TTTON
1.1.4.1. S phát tri n c a phôi ti n làm t ự ể ủ ề ổ
S phát tri n c a phôi ti n làm t ự ể ủ ề ổ trong cơ thể ầu như chỉ đượ h c nghiên cứu trên động v t, ch yậ ủ ếu là chu t nh t. Nghiên cộ ắ ứu trên ngườ ị ại b h n ch do các v n ế ấ đề ề đạo đứ v c xã h i. M i hình thái và s phát tri n cộ ọ ự ể ủa phôi đến giai đoạn phôi nang của người đều thu đượ ừc t nghiên c u trong ng nghi m (ứ ố ệ in tro vi ). M c dù ặ m i s ki n di n ra ọ ự ệ ễ in vitrođều tương tựin vivo, nhưng thời gian và tốc độ phân cắt có phần chậm hơn [6].
Ở ời điểm 20 đế th n 22 gi ICSI, hai tiờsau ền nhân s sát nh p hòa màng, h p ẽ ậ ợ t bử ắt đầ ần nguyên phân đầu l u tiên tạo thành 2 phơi bào có kích thước b ng nhau ằ chứa m t nộ ửa bào tương củ ếa t bào m , trung bình m i phơi bào s phân c t 18-20 ẹ ỗ ẽ ắ gi mờ ột lần.
Ngày 2: phơi có t ừ 4 đến 6 t bào. Nh ng lế ữ ần phân bào đầu diễn ra dướ ựi s chỉ huy của bộ gen noãn [32, 39].
Ngày 3: Phơi có 6 đến 8 tế bào (khoảng 3 ngày sau thụ tinh) b gen c a phôi mộ ủ ới bắt đầu hoạt hóa và chỉ huy q trình phát triển tiếp theo của phôi.
Ngày th 4 sau th tinh: phơi có 8 - 16 t bào. Lúc này các phôi bào g n chứ ụ ế ắ ặt v i nhau thành m t khớ ộ ối đặc g i là phôi dâu. Cuọ ối giai đoạn này, các phơi bào phân hóa rõ thành 2 nhóm t bào: nhóm t bào ngồi l n, nhóm t bào phía trong nh ế ế ở ớ ế ỏ hơn [39].
Vào ngày th 5 (kho ng 100 gi ) sau th tinh: hai dòng t ứ ả ờ ụ ế bào được bi t hóa ệ rõ: l p t bào phía ngồi m ng d t là ngu n g c c a lá ni phơi, l p t bào phía ớ ế ỏ ẹ ồ ố ủ ớ ế trong t o thành m t khạ ộ ối đẩy v m t c c c phôi t o thành ề ộ ự ủa ạ các t bào nút phôiế . Giữa các l p t bào này hình thành m t khoang ch a dớ ế ộ ứ ịch tăng nhanh kích thước,
làm cho l p màng trong su t m ng d n và b v , phơi nang thốt màng làm t trong ớ ố ỏ ầ ị ỡ ổ bu ng t cung vào ngày 6, 7 sau th ồ ử ụtinh [13].
Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển của phơi. Độ phóng đại 200X
A: hợp tử. B: lần phân cắt đầu tiên. C: phôi ngày 2.
D: phôi ngày 3. E: phôi ngày 4. F: phôi ngày 5- phôi nang
Nguồn: Bv Bưu điện 1.1.4.2. Đánh giá hình thái phơi giai đoạn phân c t ắ
Chất lượng phôi hiện nay được đánh giá chủ yếu dựa trên yếu tố hình thái quan sát trên kính hiển vi quang học, bao gồm các yếu tố: tốc độ phát triển của phôi, độ đồng đều của các phôi bào, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương. Theo đồng thuận của VSRM, hình thái phơi được chia thành 3 độ từ 1 đến 3.
•Tốc độ phát triển của phơi:
Theo đồng thuận, phôi được coi là phát triển đúng tốc độ khi có 4 tế bào vào ngày 2 và 8 tế bào vào ngày 3 phụ thuộc vào thời điểm thụ tinh. Theo một số nghiên cứu, phơi có tốc độ phân chia chậm hơn tốc độ mong đợi thường có khả năng làm tổ thấp, những phơi có tốc độ phân chia nhanh hơn mong đợi thường có bất thường và cũng có khả năng làm tổ thấp.
•Độ đồng đều của phôi bào:
Phôi ở giai đoạn 2, 4 và 8 tế bào nên chứa những phơi bào có kích thước bằng nhau. Kích thước phơi bào chỉ khác nhau khi phơi chưa hồn tất phân chia. Cách đánh
A B C
giá kích thước phơi bào cũng sử dụng hệ nhị phân để ghi nhận tất cả phơi bào có kích thước hợp lý với giai đoạn phát triển hay khơng.
Hình 1.6. Độ đồng đều của phơi bào Độ phóng đại 400X
A: Phơi 4 tế bào kích thước đồng đều. B: phơi 4 tế bào kích thước khơng đồng đều Nguồn: Bv Bưu điện
•Mảnh vỡ bào tương:
Là một khối bào tương có màng bao, khơng có nhân nằm bên ngồi tế bào. Các mức độ mảnh vỡ bào tương bao gồm: nhẹ (< 10%), vừa (15 20%), nặng (≥25%). Giá - trị tỷ lệ mảng vỡ được tính dựa trên thể tích của phơi bào, ví dụ ở phơi 4 tế bào, 25% mảnh vỡ bào tương sẽ tương đương với 1 phơi bào.
Hình 1.7. Phân loại mảnh vỡ bào tương phơi Độ phóng đại 400X.
A: tỷ lệ mảnh vỡ 0%. B: tỷ lệ mảnh vỡ 10%. C: tỷ lệ mảnh vỡ 15%. D: Tỷ lệ mảnh vỡ 20%
Nguồn: Bv Bưu điện
Việc đánh giá chất lượng phôi dựa trên tiêu chuẩn: số lượng phơi bào, kích thuớc, độ đồng đều của các phơi bào, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương. Tại labo hỗ trợ sinh sản bệnh viện Bưu điện cũng như labo của các trung tâm hỗ trợ sinh sản khác tại Việt Nam, phôi được đánh giá dựa theo tiêu chuẩn đồng thuận Alpha 2011 [19].
B A
1.2. Mối tương quan giữa tinh trùng OAT với kết qu TTTON ả
1.2.1. H i chộ ứng Oligo-astheno-teratozoospermia (OAT)
1.2.1.1. Nghiên c u v ứ ềOAT
Người ta tìm thấy trong tinh dịch của bệnh nhân OAT có sự thiếu hụt đáng kể Phospholipase C zeta (PLCζ) [3], một phospholipase đặc hiệu với tinh trùng, được coi là một marker để dự đoán mức sinh sản của nam giới [23, ]58 . Bằng chứng là khi PLCζ được giải phóng vào tế bào nỗn khi có sự hợp nhất giữa 2 giao tử gây nên một loạt các sự kiện gọi là hiện tượng "kích hoạt nỗn ", bao gồm hồn thành quá trình giảm phân, hình thành hợp tử và phân chia phơi [9].
Một khía cạnh của vơ sinh nam ít nhận được sự chú ý trước đây là vai trò tiềm ẩn của tinh trùng có lệch bội NST (nhiễm sắc thể). Người ta thấy rằng tỷ lệ tinh trùng có lệch bội nhiễm sắc thể tăng cao ở bệnh nhân OAT. Có mối liên quan giữa khả năng thụ tinh của tinh trùng và bất thường nhiễm sắc thể. Nếu sử dụng các biện pháp hỗ trợ sinh sản sẽ làm gia tăng tỷ lệ thai bất thường cấu trúc hoặc số lượng NST. Hassold và cộng sự (1978) ước tính , có khoảng 50% số trường hợp sảy thai, thai chết lưu trong 3 tháng đầu liên quan đến bất thường NST. Trong số đó, 96% có bất thường về số lượng NST, còn lại là bất thường về cấu trúc NST [22]. Jacobs và cộng sự (1992) ước tính khoảng 1/300 trẻ sơ sinh có bất thường NST thể lệch bội. Các bất thường NST có thể phát sinh từ q trình hình thành giao tử của bố mẹ hay trong q trình phân chia của phơi [24].
Các nghiên cứu mơ học được công bố từ những năm 1970 đến những năm 1980 cho thấy tỷ lệ bất thường di truyền học tế bào và bất thường trong quá trình , giảm phân hình thành giao tử ở nam giới vơ sinh, đặc biệt ở bệnh nhân OAT như lưỡng bội, disomy, nullisomy NST số 1;13;18, X, Y cao hơn nhiều so với nam giới bình thường [31,51].
Pang M.G và cộng sự (1999) phân tích NST của tinh trùng bệnh nhân OAT bằng kỹ thuật FISH cho thấy những bệnh nhân này có liên quan đến lệch bội NST 4; 6; 7; 8; 9; 10, 11, 12, 13, 17, 18, 21, X và Y [49].
Một số giả thuyết cho rằng, có sự rối loạn chết tế bào theo chương trình của tế bào mầm sinh tinh ở bệnh nhân OAT, dẫn đến có sự suy giảm nghiêm trọng số lượng tinh trùng và tăng tỷ lệ phân mảnh ADN của tinh trùng. Ty thể được cho là một trong các điều phối viên của hiện tượng chết tế bào theo chương trình, tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa biết được liệu rối loạn chức năng ty lạp thể có ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ làm tổ không. Nghiên cứu của Liu. C.H. và cộng sự (2004) cho thấy tinh trùng của bệnh nhân OAT có tỷ lệ phân mảnh ADN, , rối loạn chức năng ty thể và lệch bội nhiễm sắc thể cao hơn nam giới có khả năng