định lượng IL-10.
* Nguồn: ảnh chụp tư liệu nghiên cứu * Ng̀n: ảnh chụp tư liệu nghiên cứu
- Quy trình kỹ thuật các bước tiến hành định lượng IL-6, IL-10
Các bước tiến hành.
+ Chuẩn bị mẫu: Thuốc thử và mẫu để ở nhiệt độ phòng (18 -250 C) trước khi sử dụng. Mẫu được rã đông trong nước đá ở nhiệt độ phòng trước khi làm xét nghiệm.
+ Pha loãng chuẩn thử nghiệm: theo sơ đồ hướng dẫn của nhà sản xuất. + Chuẩn bị mẫu huyết tương và pha loãng huyết tương với dịch pha mẫu, pha loãng mẫu 5 lần (10ul huyết tương với 40ul dung môi mẫu cho đủ 50ul cho mỗi giếng).
+ Pha dung dịch rửa: Pha loãng 25ml dung dịch đệm rửa chuẩn 5x (Wash buffer) với 475ml nước cất 2 lần để được 500ml đệm rửa 1x
+ Biotinylated antibody và Avidin HRP được trộn đều trước khi sử dụng.
+ Mã hóa giếng: Chứng dương, chứng âm, nhóm chứng, nhóm bệnh nhân.
Nguyên lý kỹ thuật như sau:
+ Kháng thể đơn dòng thứ nhất được cố định trên nền giếng. + Mẫu xét nghiệm được cho vào giếng và ủ.
+ Sau đó rửa sạch phần khơng bám dính đặc hiệu, kháng thể đơn dòng thứ hai được thêm vào, đây là kháng thể đã được gắn sẵn enzyme Horse Radish Peroxidase (HRP) và được ủ một thời gian nhất định theo hướng dẫn. + Rửa sạch chất bám dính khơng đặc hiệu lần thứ 2. Tín hiệu phát quang được tạo ra bằng cách thêm vào phức hợp phản ứng hỗn hợp: 3,3’,5,5’- TetraMethyl Benzidine (TMB) và H2O2.
+ Sau khi đã ủ đủ thời gian, phản ứng được dừng bằng dung dịch Stop solution (H2SO4).
+ Đọc kết quả ELISA trên máy đo quang học ở bước sóng 450nm, bằng máy BECKMAN-COULTER-DTX 880 của Hoa Kỳ tại Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Qn y.
Tính tốn kết quả
+ Xây dựng đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên bằng các kháng nguyên đã biết dựa vào kết quả của các giếng làm chứng dương và âm. Các đường chuẩn được xác định riêng biệt cho mỗi thí nghiệm. Tính mỗi giá trị hấp thụ của tất cả các giếng chuẩn bằng cách trừ đi các giá trị OD của chứng âm. Tính tốn giá trị hấp thụ trung bình cho mỗi thí nghiệm.
Đường chuẩn được tạo ra bằng cách vẽ giá trị OD trung bình (ở bước sóng 450nm) thu được cho mỗi chuẩn nồng độ trên trục thẳng đứng (Y) so với tương ứng với TNF-α tập trung (ng/L) trên trục ngang (X). Xây dựng đường chuẩn nhờ phần mềm thống kê trong máy.
+ Các giá trị nồng độ cytokine trong các nhóm bệnh nhân và nhóm chứng sẽ được máy tính xử lý bằng phần mềm chuyên dụng, đơn vị tính ng/L.
2.2.3.8. Xét nghiệm khí máu động mạch
+ Quy trình lấy máu xét nghiệm khí máu động mạch: lấy 1 ml máu động mạch (động mạch quay hoặc động mạch đùi chung) khi vào viện, cho vào Bơm tiêm 1 ml đã tráng Heparin và gửi lên phòng xét nghiệm phân tích kết quả trong vịng 5 phút sau khi lấy máu.
Các chỉ số xét nghiệm khí máu động mạch: + pH : giá trị pH máu.
+ PaCO2: áp lực riêng phần CO2 máu động mạch (mmHg). + PaO2: áp lực riêng phần Oxy máu động mạch (mmHg). + HCO3-: Bicarbonate (mmol).
+ BE: Kiềm dư.
+ SaO2: Độ bão hòa Oxy máu động mạch (%). + Lactat.